第九章兽药残留分析.ppt

第九章兽药残留分析
二、兽药残留的危害
  　　1）急、慢性毒性
2）激素样作用
3）过敏反应 

，会增加检测器的背景噪声，难以检测痕量浓度水平的待测物质。为减少干扰和浓缩待测化合物，初始样品提取液需要采用进一步的净化步骤，如液一液分配、固相萃取、超滤、免疫亲和色谱或在线微量富集技术。

SPE 由于不需要大容量的溶剂，样品基质中的四环素类抗生素。又省时省力，固相萃取被广泛用于分离和净化生物样品中的四环素类抗生素。
TCs 具有苯环、多种活性官能团，因此各种如的 SPE 都能用于 TCs 的净化， SPE 主要包括 C18 柱、阳离子交换柱、苯基 SPE 柱等。
应用于分部环素类抗生素的固相萃取剂主要为反相 C18 吸附剂。由于四环素类抗生素易于和金属离子鳌合，为避免待测物在过固相萃取柱时的潜在损失，一般先采用 EDTA 对反相固相萃取柱进行预处理。
-液分配
可通过将待测化合物从水相转移到不互溶的有机相而直接去除基质成分。
存在问题：四环素类化合物由于极性太强，在任何 pH 值都不能被定量转移入不互溶的有机相。
当采用四丁基铵盐作为离子对试剂时，在 条件下采用二氯甲烷提取土霉素和四环素的回收率超过 85 ％。
（三）四环素类兽药的分析
四环素类抗生素残留的测定方法主要包括微生物抑制法、 酶联免疫法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱法等。样品经过提取和净化后，四环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱检测系统进行定量浦定。

微生物法是一种传统的测定四环素类化合物和其他抗生素的分析方法。
测定原理：是根据抗生素对其敏感的特定微生物的生长抑制作用 ,通过抑菌圈的大小来进行样品中抗微生物药物残留的判断(测定抑菌圈直径，样品抑菌圈直径小于阳性对照抑菌圈直径判定为阴性，否则判定为阳性)。
蜡状芽抱杆菌 ATCC 11778 是一种经典的用于分析四环素类的微生物，其对金霉素的灵敏度为 / L ，对四环素和土霉素的灵敏度为 / L ，对二甲胺四环素的灵敏度为 ~ / L 。
相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便、价格低廉、不需要精密仪器和复杂的样品前处理过程，因而适合大量样品的筛选。
微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类，因此也难以进行定量检测。

间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素。
四环素-牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源的四环素- β -酪蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊抗兔 IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体。
牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以 1 :30 的比例进行稀释后，直接采用酶联免疫法进行测定，检测限可达 5 ug / kg 。
当采用商业化试剂盒检测蜂蜜中的四环素、金霉素和土霉素残留时发现其对金霉素具有强烈的交叉反应活性。试剂盒对四环素和金霉素的检测限均为 15 ug / kg ，但由于所用抗体与土霉素的交叉反应活性较低，对土霉素的检测限为 250 u g / kg ．
实验表明，空白蜂蜜样品经缓冲液稀释 50 倍已足以消除基质干扰。

薄层色谱法（ TLC ）又分为正相薄层色谱（ NP-TLC ）和反相薄层色谱（ RP -TLC ）。
正相薄层色谱一般使用纤维素、硅胶、硅藻土等作为吸附层。总体而言，正相薄层色谱是一种简单的、不需特殊设备的分离方法，但在制板时却要花费大量时间消除 TCs 与金属离子的鳌合作用，故通常在吸附剂和溶剂系统中加入 EDTA 以消除金属离子的影响。
反相薄层色谱分析 TCs 时，溶剂系统中通常加入草酸以消除金属离子的影响．在 RP -TLC 溶剂体系中通常含有磷酸、柠檬酸、酒石酸、 EDTA 等以获得对TCs好的分离效果，但脱尾现象比较严重；在 RP-TLC 溶剂体系中加人草酸后，可以消除 TCs 与金属离子的鳌合作用，减少脱尾现象。

反向 LC 操作简单、方法灵活，已成为包括四环素类抗生素在内的许多药物残留检测的主要分析手段。普遍使用的硅胶基反向键合固定相表面存在残存的硅醇基或金属离子（如 Fe 3 ＋，A1 3 + ) ，而四环素类抗生素易与金属离子鳌合，反向柱残存的硅醇基与四环素类抗生素可以通过氢键或离子交换作用，因此导致色谱峰拖尾，保留值不稳定或过长，出