（2）氨苄青霉素抗性基因.ppt

第六章重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tet r和 Amp r。 Tet r上有插入位点 BamH I 和 Sal I; Amp r上有插入位点 Pst I 。第一节载体表型选择法 1. 原理: pBR322 pBR322 (1)四环素: (2)氨苄青霉素抗性基因: 2. pBR322 抗菌素标记选择产生?-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液( I 2 -KI- Aampicillin )(蓝灰色)褪色。抑制细菌生长,但不杀死细菌。杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。(3)环丝氨酸: 3. 选择过程: 如果在 Tet r上插入外源 DNA ,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tet r失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来; Tet r不失活的菌抗四环素,能分裂生长, 反而被环丝氨酸杀死。(1)四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基(2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果 Amp r上插入外源 DNA ,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素指示液选择。二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法?-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖 Xgal 半乳糖 5-溴-4- 氯靛蓝++ 深蓝色 1. 原理: 载体上有一段??- -半乳糖苷酶基因( 半乳糖苷酶基因( Lac Z Lac Z )的)的??片段片段(氨基端),其上有外源(氨基端),其上有外源 DNA DNA 的插入位点。的插入位点。受体菌受体菌基因组基因组中有突变的中有突变的??- -半乳糖苷酶基因( 半乳糖苷酶基因( ??片段缺片段缺失)。可以被失)。可以被 IPTG IPTG 诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组载体和受体菌基因组可以可以互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的??- -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。假阳性: 如果插入的外源 DNA 正好是 3的倍数并且没有中止密码;(不破坏??肽)。 2. 选择过程