讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测.doc

讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测.doc讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测 1960 年英国科学家从花生粉中发现的一种致癌物质- 黄曲霉毒素( aflatoxin) ,它是由黄曲霉和寄生曲霉生长后期产生的一组化学结构类似的次生代谢产物, 具有强烈的肝脏毒性, 主要污染油类食物, 如花生、玉米和大米等, 早期在食物中检测。常见的黄曲霉毒素有 B1、 B2、 G1和 G24 种,其中黄曲霉毒素 B1( AFB1) 被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物质。随着人们对药品安全的日益关注,我国针对中药材在储存过程中,极易发生霉变的现象,于中国药典 2010 年版一部中对陈皮、酸枣仁、桃仁、僵蚕和胖大海等药材中的黄曲霉毒素限量进行了规定,其中 AFB1 含量不得超过 5 μg · kg-1, B1、 B2、 G1和 G2 总量不得超过 10 μg · kg-1。在 2014 年国家药品评价性抽验中, 牛黄清心丸( 局方) 中的六神曲(炒) 为发酵产物, 容易产生黄曲霉毒素。因此对 38 批次牛黄清心丸( 局方) 样品的黄曲霉毒素进行限量检查。牛黄清心丸( 局方)收录在中国药典 2010 年版一部及第一增补本,剂型为蜜丸和水丸 2 种,处方是由牛黄、当归、川芎、甘草、山药、黄芩、炒苦杏仁、大豆黄卷、大枣、炒白术、茯苓、桔梗、防风、柴胡、阿胶、干姜、白芍、人参、六神曲(炒)、肉桂、麦冬、白蔹、蒲黄(炒)、人工麝香、冰片、水牛角浓缩粉、羚羊角、朱砂和雄黄共 29 味药材组成, 成分十分复杂。针对抽验批次较多, 检测期限较短的特点, 实验采用胶体金免疫层析技术( immune colloidal goldtechnique , GICA) , 快速测定牛黄清心丸( 局方) 中黄曲霉毒素总量和 AFB1 的含量。 GICA 是 20 世纪 80 年代发展起来的一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法。以 AFB1 为例, 其原理是使样品中的 AFB1 首先与胶体金颗粒表面的抗 AFB1 单克隆抗体反应,如果样品中 AFB1 的含量超过限量值, 胶体金的抗体位点将不再有剩余,当胶体金颗粒层析经过检测线时, 胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置, 继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠 IgG 反应,呈现出胶体金的红色条带。如果样品中不含 AFB1 或 AFB1 含量低于限值, 胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色条带,质控线也呈现红色条带。 GICA 快速检测黄曲霉毒素已在食品和中药材中广泛应用。该法使用简单方便, 非常适合现场快速检测黄曲霉毒素的残留量。本实验选用 70% 甲醇溶液提取样品中的黄曲霉毒素, 采用 GICA 法进行检测, 通过图像分析定量检测样品中黄曲霉毒素的含量。为了防止复杂基质的干扰,建议对 GICA 法检出阳性结果的样品,再经过免疫亲和柱- 高效液相色谱法( IAC - HPLC 法) 进行分析确证。 1 材料与方法 仪器 Waters e2695 分析型高效液相色谱仪,包括 Waters 2489 DAD 检测器( 美国 Waters 公司); 光化学衍生器( 美国 AURA 公司,反应线圈 15m ,灯管 254 nm) 。 Cloversil C18 反相色谱柱( mm × 150mm ,5 μm) ; I