核酸、核苷酸的基本换算.docx

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核酸、核苷酸的基本换算DNA电泳基本参数PfuDNA聚合酶BCIP/NBT&BCIP/INTHis0%45160
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PfuDNA聚合酶一、简介：PfuDNA聚合酶(PfuDNAPolymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcusfuriosis分离出的高保真(HighFidelity)耐高温DNA聚合酶。Pfu酶能纠正DNA扩增(PCR)过程中产生的错误，而传统的TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerase，Taq)，TthDNA聚合酶及它们的变体如AmpliTaq，KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma等都具有校正功能(Proofreading)，但Pfu酶是迄今发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率(errorrate)最低的。它比Taq及变体低近10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。Pfu酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA聚合酶与Pfu酶混合使用，可以部分降低产品的错误率，但效果却达不到单独使用Pfu酶时的高保真率。在基因克隆、表达和基因突变分析等现代分子生物学实验操作中，由于对DNA扩增产物的正确率要求非常高，，一般认为Pfu酶可取代Taq成为首选高保真高温DNA聚合酶。
二、浓度：-5U/Z三、活性定义：1单位Pfu酶定义为在72C,30分钟内将10nmol同位素标记的4XdNTP掺入到DE81纸不溶物质中所需Pfu酶的量。四、10'PCR反应缓冲液：100mMKCl，160mM(NH4),2SO4，20mMMgSO4,200mMTris-HCl，,1%TritonX-100，1mg/mlBSA五、质量控制：经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE检测纯度大于95%;PCR方法检测无外源DNA;能从100nglambda模板中扩增出1kb和2kb的单拷贝基因。六、储存条件：Pfu酶成品保存于50mMTris-HCl，，，%Tween-20，%NP-40，1mMDTT和50%glycerol，-20C，一年以上。七、主要应用领域：1、常规PCR2、基因的高保真扩增、克隆和表达3、基因的定点突变4、细胞内基因突变分析八、主要技术参数：Pfu酶来源于高温嗜热菌Pyrococcusfuriosis。分子量为90KD;PCR产物为平端，无3'端的单个dA;有3'?5'外切核酸酶活性(高保真)；无5'f3'外切核酸酶活性；DNA聚合时的延伸速度为每分钟600个碱基；最佳温度65-75C；dNTP的工作浓度为100-300gM，最佳Mg2+浓度为2-3mM，-;-5U/g；-20C保存至少一年。
九、PfuDNA聚合酶的使用方法：Pfu酶的使用方法基本同Taq酶。DNA扩增(PCR)时，。十、注意事项：(1)Pfu酶扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu酶具有3'^5'的外切酶活性(高保真性)所引起的