血清蛋白质醋酸纤.ppt

血清蛋白质醋酸纤
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第1页，共26页，编辑于2022年，星期二
实验目的：
掌握电泳的基本原理，了解电泳仪﹑电泳槽的基本结构与功能。
熟悉电泳的基本过程与定量方法。
熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。
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第2页，共2。电压15V/cm。通电50分钟左右，关闭电源。
6. 染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5分钟后取出，先用自来水漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗3～4次，至背景完全无色为止。
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（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。 NaOH 4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。
（2）计算:
吸光度总和（T）
=A+α1+α2+β+γ（吸光度）
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血清蛋白组分的相对百分数：
A%=A/T×100% T—吸光度总和
α1%=α1/T×100% α2%=α2/T×100%
β%=β/T×100% γ%=γ/T×100%
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(1)醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。为防止指纹污染，取膜时应戴指套或用夹子。所选薄膜应厚薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。
由于薄膜吸水性比纸小，浸泡30 min以上是保证膜片上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小泡赶走。
点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能太干。
注意事项:
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(2)缓冲液的选择
本实验常用的pH8．6巴比妥缓冲液，～ mol／L。
选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。
缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；
缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。
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(3)加样量
加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。
作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。
3. 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
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注意事项
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15～30 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳
－巴比妥钠缓冲液，～ mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨
点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果
点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果
电泳时应选择合适的电流强度，～。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散
操作过程为防止指纹污染，应戴手套
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临床意义：
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分离白蛋白(Alb)、α1、α2、β和γ-球蛋白五个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出轻微变化，往往没有特异的临床诊断价值。
分析几种疾病的电泳分析结果，可以看出较显著的变化。
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第22页，共26页，编辑于2022年，星期二
典型异常血清蛋白电泳图谱
在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓瘤(M蛋白血症型)最具有特征性，在临床上诊断意义最大。
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几种疾病的蛋白电泳变化
病名
白蛋白
α1球蛋白
α2球蛋白
β球蛋白
γ球蛋白
肾病
↓↓
↑
↑↑
↑
↓
弥温性肝损害
↓↓
↑
↓
↓
↑
肝硬化
↓↓
↓
↓
β-γ桥
原发性