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生化实验报告
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蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白质的定量测定 （ U/g）



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实验四 葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
一、实验目的：
学会用凝胶过滤层析分离物质的基本操作，深刻理解其分离物质的原理。
二、实验原理:
凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物
通过这种凝胶柱时，各物质在柱中存在两种运动，一是随洗脱液垂直向下移动，二是无定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子，不能进人胶粒内部，便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出，称为全排出)；小分子物质，直径小于凝胶孔径，能自由进出能容纳下它们的孔穴，绕道而行，结果在柱中的保留时间增长而最后流出;中等大小的分子，能进人部分胶粒内部，从而在柱中的保留时间较大分子长，但较小分子短，中间流出。于是，流过凝胶柱的混合物按其分子大小W被分离。
混合物中某一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱行为，通常用分配系数(Kd)来表示。其定义为，
Kd=（Ve一V0）/ Vi
Ve，某一被分离物成分被洗脱时所用洗脱液的体积
Vo，凝胶颗粒间自由空间的总体积，
Vi，胶颗粒内部孔穴的总容积
大分子物质，其Kd=0，小分子能全部进人胶粒内的Kd=1，中等大小分子，Kd在O～1
之间。
凝胶过滤法的分辨率（ρ）是凝胶层析中的另一个主要特征常数。从数学角度上可以表示为，
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ρ=2（Ｖ2－Ｖ1）／（Ｗ1＋Ｗ2）　（≥1）　
Ｖ2、Ｖ1，是两种被分离物的洗脱体积
W1、W2，是两个物质的洗脱峰的宽度。两个相的物质要想完全分离，ρ≥,1。
三、使用试剂及器材:
胰蛋白酶（分子量为23KD）和牛血清白蛋白（分子量68KD）混合物、蛋白marker、层析柱50cm×、核蛋检测仪、部分收集器、sephadex G一l5O
四、实验步骤:
1．凝胶的处理:取干燥的Sephadex G一l0O浸泡在洗脱液（本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热至将近1OO℃30min，还可以排除凝胶内部的汽泡（学生自己做）。
2．装柱:将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
：①用蒸馏水溶解胰蛋白酶（分子量为23KD）6
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0mg和牛血清白蛋白（分子量68KD）20mg混合物用1ml H2O溶解。.
②取下洗脱液，吸去柱床上的溶液（或自留流出），直至胶面刚露出为止，夹住下出口，使洗脱液停止流动。
③将样品沿柱壁四周缓慢加入(别搅动胶面)
④打开卡子，使下口流出液体，待样品进入胶床，夹住下出口，使洗脱液停止流动。
⑤再如上法，加１－2次小体积的洗脱液冲洗内壁，完成后，将洗脱剂与流入口相接，打开卡子进行洗脱。
4．洗脱：借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为4m1/3Omin。收集时用自动部分收集器收集，每管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时，还需要在分光光度计上测定OD28Onm来定）。
5．保存:样品洗脱完毕，根据层析图谱和自动部分收集器的数据将各组分合并，保存可以冷冻，也可浓缩，然后进行进一步鉴定。
：取下层析柱，将上下口的盖子取下，从上口处用吸耳球一吹，胶即可从下口流出， 凝胶可以灭菌保存，干燥保存（乙醇乙醚脱水干燥），和防腐剂保存。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
一、实验目的：
学会用聚丙烯酰胺凝胶分离物质的基本操作，深刻理解此法分离物质的原理。
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二、实验原理:
以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为TEMED。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶不连续体系与非解离体系，电泳迁