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蛋白质双向电泳实验报告
现代生物学技术
实验报告
题 目 蛋白质双向电泳技术
姓 名 学 号
专 业
小组成员
指导教师
中国?武汉
年 月
联系方式:
大肠杆菌组蛋白双向电泳技术
摘要:， 40%的TCA(每组做4管，做好标记)。
8、混匀后，放置在冰上5min。
9、12000rpm， 4?离心10min，倒掉上清
10、加入1ml丙酮洗涤沉淀， 12000rpm， 4?离心5min，重复三次 11、最后倒出丙酮后，再短暂离心，用移液枪吸出残余的丙酮 12、打开离心管的盖子，室温放置10-15min，使丙酮完全挥发 13、向离心管中滴加50ul样品溶解液， 4?放置至少3h，溶解蛋白样品。
制备蛋白样品所需试剂
1(细胞洗涤液 PBS buffer
氯化钠 8g
氯化钾
NaHPO 24
KHPO 24
向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解
，然后加入去离子水定容至1L.
灭菌后室温保存
2(蛋白沉淀剂 40%三氯乙酸(TCA)
40g TCA加水定容至100ml
3(丙酮
4(核酸酶
5. 蛋白酶抑制剂 (cocktail，片剂)
6(样品溶解液: 尿素 7M
硫脲 2M
CHAPS 4% MilliQ水 定容至10ml;分装成10小管，每小管1ml，-20?冰箱保存。
注:不要反复冻融，分装保存
蛋白定量
蛋白定量方法
标准曲线法测定蛋白质的含量
管号 1 2 3 4 5 6
标准蛋白液0 (mL)
蒸馏水(mL) 1
考马斯亮蓝G-4 4 4 4 4 4 250(mL)
蛋白含量(μg) 0 10 20 40 60 80
OD 0 595nm
步骤:
1、 ，标记管号1-7
2、 在1-6号管中，按上表加入标准蛋白液( BSA)，蒸馏水，
考马斯亮蓝R250，混匀后室温放置5min
3、 从冰箱中取出溶解的蛋白样品，用移液枪反复吹打几次，12000rpm，
4?离心10min，之后将上清转移到一新的离心管中
4、 取合适体积的蛋白样品加入7号管中，加蒸馏水补足至1ml，考马斯
亮蓝G-250 4mL，混匀后室温放置5min.
5、 用分光光度计测得1-7号管中溶液的光密度OD，(测之前注意调595nm
零，以1号管为空白对照调零)
以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标(六个点为10µg、20 µg、595nm
30 µg、40 µg、50 µg)，在坐标轴上绘制标准曲线。
6、 利用标准曲线查出回归方程A595nm=aX+b。
7、 根据回归方程计算样品蛋白质含量
实验结果:经试验得知:标准曲线方程为Y=+
其中，Y:吸光度(OD值) 595nm
X:蛋白质含量(g)
2. 第一向分离——等电聚焦
上样方法
1. 从-20?取出保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。
2. 从小管中取出水化上样缓冲液，加入适量样品、两性电解质(-1%)和溴酚蓝，充分混匀。
3. 沿着聚焦盘中槽的边缘从左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生 气泡。否则影响 到胶条中蛋白质的分布。
4. 取出-20?冷冻保存的IPG预制胶条(7cm pH 3-10)，室温中放置10分钟。
而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5(将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。 6. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,)， 防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电
聚焦程序。
7cm胶条
水化 12小时(20?) 主动水化(50V) S1 250V 线性 30分钟 除盐 S2 500V 快速 30分钟 除盐 S3 4000V 线性 3小时 升压 S4 4000V 快速 20,000伏小时 聚焦 S5 5