高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法
(high performance liquid chromatograph------HPLC)
药物分析教研室
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第一页，共八十三页。
HPLC法以经典LC为基础，引入GC的理论与技术，并加以改进而发梯度洗脱
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化学键合相的类型
全多孔硅胶为基体
键合相的表面结构：
单分子键合 Si-O-C， Si-O-Si-C
聚合键合 Si-O-Si-C
结合的化学键类型： Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C
极性：非极性、中等极性、极性
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1)非极性键合相：
表面基团为非极性烃基，C18、C8、甲基、苯基等，用作反相色谱的固定相。
最常用的非极性键合相是十八烷基键合相（ODS键合相），洗脱剂多为强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。
常用CH3OH—H2O作流动相，极性大先出峰，极性小后出峰。
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反相色谱常用的微粒键合相
官能团 载 体 颗粒直径
十八烷基 Zorbax 3~10 um
辛 烷 基 Nucleosil 100A 3~10 um
苯 基 m porasil ~7 um
二甲硅烷 Lichrosorb 3~10 um
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2)中等极性键合相
常用的有醚基键合相，既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。
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3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。
可用作正相色谱的固定相，洗脱剂常用非极性或弱极性溶剂，加入适量的极性溶剂，以调节洗脱强度。
极性小的先出峰，极性大的后出峰。
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正相色谱常用固定相结构
氰 基 -(CH2)3C=N
氨 基 -(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇 -(CH2)3OCH(OH)CH2OH
二甲氨基 -(CH2)3N(CH3)2
二 氨 基 -(CH2) 3NH(CH2)2 NH2
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常用流动相及其选择
选择流动相：
（1）化学性质稳定。
（2）粘度小。
（3）溶剂的纯度要高。
（4）沸点低（制备型）。
（5）与色谱系统的适应性好。
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液固色谱流动相
选择原则
极性大的试样用极性强的洗脱剂
极性小的试样用极性弱的洗脱剂
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度(ε0)参数来衡量；
分离复杂试样，采用梯度洗脱。
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液固色谱中流动相的选择
(1) 强溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力强的溶剂，洗脱溶质分子的能力也强。
(2) 弱溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力弱的溶剂，洗脱溶质分子的能力也弱。
(3) 结合能eo eo值越大，溶剂为强溶剂。常用：正已烷、异辛烷、氯仿、异丙醇、乙腈等。
(4) eo的特点 溶剂强度与溶剂的体积百分比不成线性关系。
(5) 含水量的控制 通过有机修饰剂的调节，控制硅胶的含水量。
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反相色谱流动相
注意：
A 缓冲离子不能产生沉淀。
B 溶剂的紫外切点必须小于所使用的检测波长。
C 避免使用卤族离子。
D pH 调节在2~。，否则硅胶将被溶解！
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反相色谱的流动相
最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、四氢呋喃等。
主要组成是水，极性和表面张力最高，最弱的流动相，以此洗脱非极性组分时，表现出的滞留时间最长。
甲醇和乙腈，是最常用的调节剂。（因为甲醇和乙腈的紫外切点相对较低，且粘度较小，及易于提纯。）
规律：水量越高，保留时间越长。
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规律
①组分分子结构对保留值的影响：组分的保留值与其分子中非极性部分的总表面积越大，保留值也越大。
②烷基键合相的特性对保留值的影响：随碳链的加长，组分的保留值增加，对组分分离的选择性也增加。
③流动相性质对保留值的影响：流动相的表面张力越大、介电常数越大，其极性越强，流动相的洗脱强度越弱，组分的保留值越大。
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正相色谱的流动相
正相色谱的流动相最常用的是烷烃溶剂。如：正戊烷、正己烷、正庚烷、环已烷等。
流动相的极性越强洗脱能力越强，也就是强