罗氏实时荧光定量pcr仪.ppt

实时荧光定量PCR仪
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一、实时荧光定量PCR的原理
荧光定量 PCR
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板eacon（分子信标）
Lightcycler上开发独有的分析模式：
Hybridization Probe Format（杂交探针）
SimpleProbe （单探针）
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SYBR-Green I 检测模式
SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中， SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。 SYBR Green I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。
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水解探针（Taqman ）检测模式
同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。
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分子信标（Molecular Beacon Probe）
独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5’端标记荧光分子，3’端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。
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杂交探针（HybProbe）检测模式

设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。
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Annealing
Elongation
End of Elongation
Denaturation
Fluorescein
LC Red
for sequence specific detection of DNA
杂交探针检测－罗氏专利性技术
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Template: Plasmid; Target: CycA; Detection Format: Hybridization Probes
Standard Calculated concentration
+9
+9
+7
+7
+6
+4
+4
+2
+1
+1
H2O
+10
+9
+8
+7
+6
+5
+4
+3
+2
+1
H2O
杂交探针的优点：




Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization Probes
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专用于SNP基因分型和突变检测的
SimpleProbe
SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多态位点的准确分析结果。
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Denaturation phase:
SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched
Annealing phase:
Fluorescence from reporter dye increases when probe is anneale