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CytoScan Assay 中文手册 gDNA ≥ 50ng/ μL关于振荡: Mix :高速振荡 3次,每次 1秒 Reagents : 3次,每次 1秒酶:快速振荡 1秒关于离心:板:除片段化步骤要求 4℃外,其余均室温, 2000rpm 离心 1分钟 Reagents 和酶:离心 3秒关于酶:以下步骤用到的所有酶均到用时才能从冰箱拿出,用完立即放回-20 ℃ Stage 1: 消化 gDNA 高速振荡 3次,每次 1秒混匀, 2000rpm 离心 1分钟。 × Nsp I Buffer 和100 × BSA 室温融化, 振荡、离心,冰上放置。 3. Nsp I enzyme 放于-20 ℃,用时才能拿出来。 4. PCR 仪要先预热。 (+) 加5μL Genomic DNA ,阴性对照管(-)加5μL low EDTA TE. Digestion Master Mix 。 Mix 振荡混匀并离心。 Mix 分管加至模板中。 PCR 板高速振荡 5次,每次 1秒; 2000rpm 离心 1min 。 10. 按上图右侧的程序运行。 Stage 2 :连接 PCR 仪,将板放于室温。 × T4 DNA Ligase Buffer( 约 20min) 和50μM Adaptor,Nsp I 室温融化, 振荡混匀, buffer 变清澈,离心,冰上放置。 2000rpm 离心 1min ,冰上放置。 Ligation Master Mix. 5. Mix 高速振荡 3次,每次 1秒;离心 3秒。 Mix 分至各消化管。 PCR 板高速振荡 5次,每次 1秒; 2000rpm 离心 1min 。 。 Stage 3A : PCR , 2000rpm 离心 1min 。 。 ,高速振荡 5次, 2000rpm 离心 1min ,冰上放置。 PCR 产物每个模板分成 4管,每管 10μL。如下图 5. PCR 仪预热。 × TITANIUM Taq PCR Buffer, dNTP Mixture, PCR Primer 002 室温融化,混匀并离心, 立即置于冰上。 GC-Melt Reagent 和 Affymetrix Nuclease-Free wate r 置于冰上。 master mix 。 3次,每次 1秒。 master mix 分装至各管。 10. 高速振荡 5次,每次 1秒。重复振荡一次, 2000rpm 离心 1min 。 11. 按上图右侧的程序运行。此步 PCR 一定要用银质板或金包银板的 PCR 仪。 Stage 3B : PCR 产物验证 的 PCR 管, 各加入 5μL的 Affymetrix ? Nuclease-Free water 和2μL 的 USB 5× RapidRun ? Loading Dye 。 PCR 产物中各抽取 3μL 加入至上一步的混合液中,得到 10μL的产物 mix ,振荡混匀并离心。 8μL产物 mi