免疫组化实验步骤.docx

免疫组化操作步骤
一、实验原理与意义 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新 技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性
PBS洗3次各2分钟
滴加生物素化II抗，20C-37C 20分钟
PBS洗3次各2分钟
滴加试剂SABC 20C-30C 20分钟
PBS洗4次各5分钟
DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色 14)脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化问题解答
1、 染色过强
原因 解决方法
a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度
c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、 非特异性背景染色
原因 解决方法
a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟
b组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H202封闭孵育时间延长
c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、 染色弱
原因 解决方法
a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟
b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液 使试剂稀释 （应防止切片干燥）
d 室温太低 低于 15 度 要改放在 37 度孵育箱孵育 30-60 分钟或 4 度冰箱过夜
e 蛋白封闭过度 封闭不要超过 12 分钟
4、染色阴性
原因 解决方法
a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照
b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果
c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误
三步法（SP系列），实验步骤使用说明：
SP9001 （兔）适用于兔来源的一抗
SP9002 （小鼠）适用于小鼠来源的一抗
SP9003 （山羊） 适用于山羊来源的一抗
SP9000 （通用型） 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
-价格 ¥ / -价格 ¥ / 18ml-价格 ¥ 试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml （50 片）/6ml（120 片）/18ml（360 片）
贮存条件：本试剂盒宜4°C保存，稳定期1年
一、试剂盒内容
试剂 1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清） 即用型
试剂 2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊） 即用型
试剂 3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物 即用型
试剂 3 过氧化物酶标记链酶卵白素 即用型
实验步骤简介：
细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片， PBS室温10分钟复水。
修复：滴加复合消化液（％ +%+ EDTA% ） （ ） 4度30-40分钟 PBS 洗三次，每次一分钟
血清封闭：（试剂 1）室温 10 分钟，倾去。
一抗：37°C 1小时或4度过夜
PBS 洗三次 每次三分钟
相应的生物素化二抗（试剂2） 37C 30-40分