荧光荧光显微镜和荧光分光光计详解演示文稿.ppt

荧光荧光显微镜和荧光分光光度计详解演示文稿
第一页，共三十八页。
优选荧光荧光显微镜和荧光分光光度计
第二页，共三十八页。
第三页，共三十八页。
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素了荧光会逐渐减弱。若将标
本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间防止封
裱剂蒸发。 
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”—无或可见微
弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明
亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。
第十四页，共三十八页。
荧光分光光度计工作原理：
 由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发
光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光
物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照
射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放
大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动
的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，
固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波
长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱
（emission spectrum），简称荧光光谱。
7 荧光分光光度计
第十五页，共三十八页。
当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱（emission spectrum）。
 当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。
第十六页，共三十八页。
荧光分光光度计原理图
荧光分光光度计的基本结构是 :
光源 单色器或滤光片 样品池 单色器或滤光片 检测器
第十七页，共三十八页。
注意事项：
（1） 注意开机顺序。
 （2） 注意关机顺序。 
（3） 为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高
压、狭缝的设置一般不宜选在高档。
（4） 关机后必须半小时（等氙灯温度降下）
方可重新开机。
第十八页，共三十八页。
8 荧光技术的应用
（1） 免疫荧光技术
用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。
将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。
用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。
第十九页，共三十八页。
直接法
荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。
直接荧光抗体染色法示意图
第二十页，共三十八页。
间接法
特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意图
第二十一页，共三十八页。
染色程序分为二步，最终使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。
抗补体染色法
第二十二页，共三十八页。
优点
缺点
直接法
特异性高，操作简便，比较快速。
一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。
间接法
既能检查未知抗原，也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同 的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。
由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。
补体法
即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。
参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。
第二十三页，共三十八页。
（2） 作为生物大分子筛选与鉴定的标记物

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，其基
因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围