脲酶Km值的测定(2009).doc

脲酶 Km 值的测定一、[ 背景与目的] K m 值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。测定 K m 在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等中均具有重要意义。当环境温度、 pH 值和酶的浓度等条件相对恒定时, 酶促反应的初速度 v 随底物浓度[S] 增大而增大, 直至酶全部被底物所饱和达到最大速度 V。反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示,即米氏方程式: 对于 K m 值的测定,我们通常采用 Lineweaver-Burk 作图法,即双倒数作图法。具体做法为:取米氏方程式倒数形式。若以 1/v 对 1/[S] 作图, 即可得下图中的曲线, 通过计算横轴截距的负倒数, 就可以很方便地求得 K m 值。本实验从大豆中提取脲酶, 脲酶催化尿素分解产生碳酸铵, 碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用,产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内,呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度( 单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比) 。具体反应如下: (1) 酶促反应(2 )呈色反应通过本实验学习大豆脲酶的提取方法;掌握脲酶米氏常数 Km 的测定方法。二、[ 仪器与试剂] 1. 仪器(1) 721 型分光光度计(2) 恒温水浴锅 2. 试剂(1) 尿素溶液(2) =-HCl 缓冲液(3) 10%ZnSO 4 溶液(4) 溶液(5) 10% 酒石酸钾钠溶液(6) 奈氏试剂三[ 实验方法] 1. 脲酶提取液的制备(由老师准备) 支试管编号, 按下表加入试剂和操作, 加入试剂量单位为 mL 试管编号 01234 尿素 每管中尿素的 mol 数 × 10 -55× 10 -5 × 10 -52× 10 -5 × 10 -5 蒸馏水 — PH=7Tris- 盐酸缓冲液 25℃恒温水浴,预温 5min 脲酶提取液— 煮沸的脲酶 ———— 25℃恒温水浴,准确作用 10min 10%ZnSO 4 充分混匀,过滤另取 5 支试管,与上述离心管对应编号,如下操作上清液 蒸馏水 10% 酒石酸钾钠 钠氏试剂 混合均匀,以对照管调零,在 480nm 处,读取各管的 A 480nm 值 A 480nm