蛋白质组与蛋白质结构分析.ppt

学习提纲
重点
蛋白质的分离与鉴定方法、蛋白质芯片分析技术以及酵母双杂交技术。
蛋白质二级结构预测方法及其软件、蛋白质三维结构预测方法及其软件。
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难点
蛋白质二级结构和三维结构算法以及软件的使用。）顺序排列成的图谱。
质谱分析法是按照离子的质荷比大小对离子进行分离和测定，从而对样品进行定性和定量分析的一种方法。
二、蛋白质组质谱分析技术
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质谱仪（mass spectrometer）是利用电磁学原理使离子按照质荷比进行分离，从而测定物质的质量与含量的科学实验仪器。
（一）质谱仪
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（matrix assisted laser desorption/ ionization，MALDI）
利用激光脉冲将与基质结晶混合的蛋白质样品升华并电离出来。
2. 电喷雾（electrpspray ionization，ESI）
将分析物从溶液中电离出来，可以方便地与液相色谱（liquid-chromatography，LC）联用。
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生物质谱通过与特异性蛋白酶解相结合，可测定肽质量指纹图（peptide mass fingerprint，PMF），并获得全部肽段的准确分子量，结合蛋白质数据库检索就可实现蛋白质的快速鉴别和高通量筛选。
（二）质谱的应用
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串联质谱技术可直接用于肽段的测序，从一级质谱产生的肽段中选择母离子进入二级质谱，经惰性气体碰撞后，肽段沿肽链断裂，由所得各肽段质量数差值推定肽段序列，并用于数据库查寻，称为肽序列标签技术（peptide sequence tag, PST），目前广泛应用于蛋白质组大规模筛选。
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利用生物质谱的准确分子量测定特性，同时结合碘乙酰胺、4-乙烯吡啶等化学试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化以及蛋白质酶切、肽谱技术等，可实现对二硫键和自由巯基的快速定位。
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如用MALDI-TOF-MS 对双向电泳分离蛋白质磷酸化位点进行定位、MALDI-TOF-MS结合不同酶解方式确定糖基化位点等。
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1．MALDI-TOF质谱测定肽质量指纹图
将质谱分析获得的肽段分子质量与蛋白质数据库中理论肽段的分子质量进行比较，通过软件分析可获得蛋白质信息，根据匹配情况判断出所鉴定分析的蛋白质是已知的还是未知的。
（三）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析技术
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2．MALDI-TOF质谱技术用于蛋白质C-端序列分析
在质谱仪内，应用源后衰变（post-source decay, PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation, CID）可产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰质谱。此外，用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去不同数目氨基酸，亦可形成大小不同的一系列梯形肽片段，所得的一定数目肽质量由MALDI-TOF-MS测量。
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1．电喷雾电离质谱测定蛋白质和多肽分子质量
蛋白质和多肽分子经电喷雾电离时，会吸附一个或多个质子，形成一系列带电荷状态不同的分子离子，在质谱中形成荷质比不同的谱峰。一般可根据谱峰的同位素离子峰分布情况以及利用相邻两峰的荷质比和电荷数关系计算求得离子分子质量。
（四）电喷雾质谱分析
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2．液相色谱-电喷雾质谱法鉴定双向凝胶电泳蛋白质
对双向凝胶电泳分离的蛋白质点经酶解后的多肽混合物进行液相色谱-电喷雾质谱联用（LC-ESI MS） 鉴定分析，同样可以得到PMF。
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串联质谱的使用能够对基于PMF的结果进行再分析或对未赋值的质谱峰信号进行研究。对于初始用PMF法鉴定的蛋白，可选择其中部分肽段峰进行MS/MS分析，得到肽段的序列。
（五）串联质谱（MS/MS）
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三、蛋白质芯片分析技术
蛋白质芯片（protein chips）技术又称蛋白质微阵列（protein microarrays），是一种高通量的、小型化的、平行性的生物检测技术。
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原理
蛋白质芯片是将已知蛋白点印在固定于不同种类支持介质上，制成由高密度蛋白质或多肽分子微阵列组成的蛋白微阵列，阵列中固定分子的位置及组成已知，未经标