EMSA实验体会.docx

非放射性EMSA
EMSA是一个比较复杂的试验技术,由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了,做了大概也有几百次吧,那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果,到现在为止还有没有解决的,找不到原因的一个问题,呵呵!
为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的，后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度，最终得到阳性结果!所以这个设计很关键!!!
给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！！！二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些，，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.
核蛋白样品的制备;
制备蛋白样品的关键是:，，，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的！一般要求在lug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，.
同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果！！
探针的制备:
又很多站友都在问我生物素标记到3'端还是5'端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下:合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---.
！下面会更细的谈到.
技术要点:
关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了！
制胶必须是非变性PAGE凝胶，%的非变性胶•制胶很重要,直接影响电泳的效果！一般控制在5分钟凝固的效果.

40%Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）
50%Glycerol（50%甘油）
dH20（蒸馏水）
TEMED（四甲基乙二氨）20M
脱气10min
10%AP（过硫酸氨）120M

一般试剂盒包括的试剂
l10XBindingBuffer（10X结合反应液）（-20oC）
lPoly（dI:dC）（dI:dC）（聚核苷酸竞争物）（-20oC）
l6XLoadingBuffer（10X上样缓冲液）（4oC）
lColdoligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）（-20oC）
lBiotin-LabeledProbe（生物素标记探针）（-20oC）
lStreptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）（4oC）
l2XBlockingBuffer（2X封闭液）（4oC）
l5XWashingBuffer（5