实验设计及技术路线.docx

竞赛设计及技术路线
研究目的
本课题针对严重影响植物生长的安全因素一一软腐害，在前期课题组研究 植物生物防治和保护的基础上，选取南方红豆杉为研究材料，通过对南方红豆 杉内生菌进行分离和纯化，进一步通过拮抗实验，探索其对半夏软腐病菌、白 竞赛设计及技术路线
研究目的
本课题针对严重影响植物生长的安全因素一一软腐害，在前期课题组研究 植物生物防治和保护的基础上，选取南方红豆杉为研究材料，通过对南方红豆 杉内生菌进行分离和纯化，进一步通过拮抗实验，探索其对半夏软腐病菌、白 菜软腐病菌、番茄软腐病菌等植物软腐病菌的抑制效果，以期为半夏等中药 材、白菜等农作物等植物软腐病的生物防治提供优良的菌株材料，从而为植物 的绿色、安全、健康生长提供理论和技术支撑。
研究意义
南方红豆杉，作为植物资源库中的一株奇葩，在材质、药用等方面起着非常 重要的作用，鉴于其富产紫杉醇等多种药用活性物质的优点，本课题旨在将南方 红豆杉资源进一步优化利用，深入挖掘其在抗菌性、抗病性等方面的潜在价值。 植物内生菌，作为一种新型微生物资源，目前受到了广泛的关注，从内生菌中寻 找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点，近年来已发现了一些有 医用、农用价值的菌株和化合物。本文主要以南方红豆杉为研究对象，研究其内 生菌的多样性，并从中分离出对植物软腐病菌具有抑制作用的拮抗菌株，以进一 步加强南方红豆杉植株内生菌的菌种研究，深化对植物软腐病的防治作用研究， 并为生物防治菌剂的开发和研制积累理论基础。为深入研究植物软腐病的生物防 治机理奠定基础，为南方红豆杉的资源应用开辟新的途径。
实验方案及技术路线


南方红豆杉植株采集时间为2012年5月至8月，采集于浙江省金华市婺城 区南部山区，选取
1-3块代表性种植地，采用五点采样法，采集南方红豆杉整个 植株，每点5株，分别采取南方红豆杉的根、茎、叶，存入牛皮纸带，做好记录， 立即带回实验室进行内生菌的分离。


取采集的南方红豆杉植株根、茎、叶，用自来水充分冲洗后，分装在三个平板上， 移至已灭好菌的超净台上，点燃酒精灯，用酒精擦拭手，首先将根用无菌水冲洗2 次，再移至70%乙醇浸泡20S，再用2%次氯酸钠浸泡2min，无菌水冲洗3次。保留最后 两次冲洗液，取最后一次冲洗液适量于NA培养基中，进行涂布，完成后注明标记。 取根的最后第二次冲洗液将茎进行第一次冲洗，最后一次的冲洗液进行茎的第二次 冲洗，依次进行上述操作。

采用2种方法验证样品表面消毒效果:①组织印迹法:将以上消毒后的样品， 贴放于NA培养基表面5min后，将培养皿于30°C培养3-5天，观察微生物生长 情况。②消毒液涂板法：将表面消毒的最后一次冲洗液涂布于NA平板上，于30C 培养3-5天，观察微生物生长情况。如果有菌生长，表明表面消毒不彻底。两种 检测方法均证明以上样品处理和消毒方法可行。

、放线菌分离：样品表面消毒、晾干后转入加有9mL无菌水无 菌研钵中研磨匀浆，取原液、稀释10倍液和100倍液，然后分别涂于NA/高氏1 号平板上,每个稀释度设3个重复，平板倒置在28C的培养箱内培养。细菌培养 24