高效毛细管电泳.ppt

高效毛细管电泳
生物基础实验中心生物化学分室
2010年10月
Capillary Electrophoresis (CE)
毛细管电泳的组成部分
电解质缓冲液
获取数据
毛细管
入口
毛细管
出口
缓冲尝试电化学检测器
有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器
需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测
大分子检测
蛋白、核酸
- 可以首先选择紫外检测器
- 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方
法标记荧光，然后用LIF检测
- 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后
再LIF检测
- 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测
多糖
- 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测
- 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV
的方式检测
检测器
激光诱导荧光 (LIF) 488， 635 nm
蛋白 化学标记：FITC 488 520
罗丹明 488 560
免疫标记
DNA 标记引物
嵌合
糖谱 APTS 标记
第二章 毛细管凝胶电泳（CGE）
毛细管凝胶电泳 (CGE)
双功能胶 (纤维素及衍生物溶液5%，每次更新)
动态涂层，增大黏度，降低EOF；
筛分胶；
涂层毛细管
蛋白分子量测定(SDS-Mw kit)
核酸片断分析(ds DNA 1000 kit)
Physical gel
(linear)
Chemical gel
(cross linked)
蛋白质分子量的测定
Minutes




















10K
20K
35K
50K
100K
150K
225K
Goodness of fit:







SDS-Mw 分子量测定 双功能胶 CGE
ss DNA 100-R kit ds DNA 1000 kit
单链和双链核酸分析
寡核苷酸
PCR产物
第三章 分离条件选择流程
分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：
第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成
及其性质；
第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，
若无样品信息可先选CZE；
第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外
吸收；
第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤
除蛋白等；
第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75µmID
毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;
第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、
缓冲试剂浓度等；
第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和
温度等；
第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；
第九步，确定是否需要换用其他分离模式。
在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：
1) 最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。
2) 毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。
3) 欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试
剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。
4) 欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、
缓冲液、温度、电压、洗涤等。
第四章 各类物质的分离要点
阴离子及有机酸
- 此类物质没有