《蛋白质共价结构》.ppt

第4章 蛋白质的共价结构
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1 蛋白质通论
形状和大小
按形状和溶解度分类：
纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋白、胶原蛋白 物的RNA聚合酶和牢固结合
④ 鹅膏蕈碱
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CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH
CH2
CH2
CHNH2
COOH
CH2
SH



谷胱甘肽—存在与动、植物及
微生物中：


保护巯基酶或含Cys的蛋白质中
SH的还原性
防止氧化物积累
2GSH
GS-SG
⑤ 谷胱甘肽
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3 蛋白质一级结构的测定
① 测定蛋白质分子中多肽链的数目
② 拆分蛋白质的多肽链
③ 断开多肽链内的二硫桥
④ 分析每一多肽链的氨基酸组成
⑤ 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基
⑥ 裂解多肽链成较小的片段
⑦ 测定个肽段的氨基酸序列
⑧ 重建完整多肽链的一级结构
⑨ 确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥位置
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Sanger于1953年第一个测定氨基酸序列
---牛胰岛素（insulin）
(获1958年诺贝尔化学奖)
DNFB(2,4-二硝基氟苯)—— N末端
21
30
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蛋白质的N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量
测定蛋白质分子中多肽链数目
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拆分蛋白质的多肽链和断开多肽链内的二硫桥
①非共价键：
血红蛋白（四聚体）
断裂：8mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍
②二硫键：链内或链间
还原：过量的β- 巯基乙醇（pH8~9）
保护巯基：烷基化试剂（碘乙酸）
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水解破坏肽健
氨基酸混合物
柱层析分离测定氨基酸
（主要是酸水解，同时辅以碱水解 ）
氨基酸组成的分析
氨基酸组成：
用每摩尔蛋白质中含有氨基酸残基的摩尔数，
或每100g蛋白质中含有氨基酸的克数来表示。
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N末端和C末端氨基酸残基的鉴定
(1) N末端
① 2，4-二硝基氟苯（DNFB)法***
② 丹磺酰氯（DNS)法
③ 苯异硫氰酸酯（PITC)法*****
④ 氨肽酶法
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DNFB
弱碱性溶液中
（DNP-蛋白质）
黄色化合物
（Sanger试剂）
与蛋白质氨基发生反应
酸水解
肽健断开，
DNP-基不脱落
DNP-氨基酸能溶于
有机溶剂而与其他aa分离
层析鉴定DNP-氨基酸
① 2，4-二硝基氟苯（DNFB)法
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DNFB
DNP-蛋白质
DNP-氨基酸
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② 丹磺酰氯法（DNS法）
原理与DNFB法相同
丹磺酰基有强荧光，灵敏度
比DNFB法高100倍
水解后DNS-氨基酸不需提取
直接用层析鉴定。
(DNS-氨基酸)
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③ 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、Edman降解法 ）
PITC
弱碱性条件下
与末端氨基反应
PTC-肽
PTH-氨基酸
酸性有机溶剂
加热
层析鉴定
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特点：剩下的肽链仍是完整的。
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每次只从蛋白质的N端解离和鉴定一个aa残基
还可用来测定氨基酸序列
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④ 氨肽酶法
肽链外切酶，从肽链N-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。
Ala
Val
Gly
Ala-Val-Gly
局限性：酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断氨基酸残基的顺序。
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(2) C末端
①还原法
②肼解法
③ 羧肽酶法
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C末端氨基酸
硼氢化锂还原
α氨基醇
肽链水解
层析法鉴定
① 硼氢化锂还原法
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② 肼解法
多肽与肼在无水条件下加热，可断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用层析鉴定。
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③ 羧肽酶法
肽链外切酶，从肽链C-末端逐个降解，释放出游离氨基酸。
反应时间
氨基酸释放量
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多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化
① 酶裂解法**：（酶的专一性）
A 胰蛋白酶( Trypsin）： R1=赖氨酸、精氨酸 但R