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第三章 高效液相色谱法
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第一节 高效液相色谱法的特点
 以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（PEEK）
容积：~
放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差
 注意：密封、过滤
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2、流动相----过滤、脱气
流动相过滤的目的
过滤去除可能存在的微小固体颗粒，保护色谱高压泵和色谱柱
流动相过滤方法
在线过滤
抽真空过滤
过滤用膜：水系和有机
孔径：µµm
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流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确
输液均匀准确，并且脉动减小
保留时间及色谱峰面积的重现性提高
提高检测的性能
防止气泡引起的尖峰
基线稳定，信噪比增加
溶剂的紫外吸收本底降低
保护色谱柱
减少死体积
防止填料的氧化
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常用的脱气方法有：
①吹氦脱气法：
原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。
特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少
②加热回流法：脱气效果也比较好
③抽真空脱气法：
特点：可以一次完成过滤和脱气任务
注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系
④超声波脱气法
简单，但效果不理想
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常用的脱气方法（续）
⑤在线真空脱气法
把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。
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二、高压输液系统
高压输液泵性能：
①泵体材料耐化学腐蚀
②能在高压下连续工作
③ 输液流量范围宽
④输出流量稳定、重复性高：流量控 制的精密度应小于1%（% ），重复性 %
高压输液泵分类：恒压泵和恒流泵
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1、恒流泵
输出恒定体积流量的流动相
注射型
恒流泵
往复型 双柱塞往复式并联泵
双柱塞往复式串联泵
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往复型泵
目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵
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往复型泵
优点：
☺可以在高压下连续以恒定的流量输液
☺液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低
☺更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱
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往复型泵
缺点：
 流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析
 柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染
 长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转

柱塞式往复泵是HPLC中应用广泛，也是最重要的高压输液泵
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双柱塞往复式串联泵示意图
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2、恒压泵（气动放大泵）—输出恒定压力的泵
优点：
☺能以比较简单的方式建立高压并输出无脉动的恒压流动相液流
☺适合和折光示差检测器配合使用
☺可以利用改变气源压力的方法来调节载液流速
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缺点：
 不能输出恒定流量的流动相
 色谱峰的重复保留时间差
 不能获得可靠的定性结果
 液缸体积大（约70ml)，更换载液时操作不便
目前恒压泵主要用于色谱柱的制备，配合装柱用的匀浆装柱机，可以快速建立所需的高压输出
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单液缸气动放大泵示意图
气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压力
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3、输液系统的辅助设备
主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置
4、梯度洗脱装置
梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术
影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类
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四元低压梯度系统
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三、进样装置
1、进样器进样
进样前打开流动相泄流阀

用注射器进样
关闭泄流阀，完成一次
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2、六通阀进样装置
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一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈
进样针
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3、自动进样器
工作站按预定程序自动完成取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的移动等所有步骤
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高压进样环进样原理
样品瓶置于进样针下方
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高压进样环进样原理
进样针穿过