因工程制药工艺.ppt

关于因工程制药工艺
第一张，共六十一张，创建于2022年，星期二
第六章 基因工程制药工艺
基因工程制药微生物表达系统
基因工程大肠杆菌的构建
基因工程菌的发酵培养与控制
第二张，共六十一张，创建于2涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
4、4℃ 12,000 g离心15 min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。
第十六张，共六十一张，创建于2022年，星期二
6、 ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5~10 min。
7、4℃ 12,000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5 min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5~10 min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50 l H2O，TE buffer溶解RNA样品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。
第十七张，共六十一张，创建于2022年，星期二
RNA提取注意事项
严格防止RNA酶污染
1. 佩戴一次性手套
2. 玻璃器皿可以在250℃烘箱中烘烤3小时
3. 枪头、%DEPC（搅拌搅匀）水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣去液体，高压灭菌30分钟。
DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
4. DEPC处理的水：%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒
5. 防止环境中RNA酶污染
第十八张，共六十一张，创建于2022年，星期二
2. 转cDNA（防RNA酶）
逆转录: 将mRNA转录成为cDNA
逆转录酶：依赖于RNA 的DNA聚合酶(反转录酶)
禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶
鼠白血病病毒(MLV)反转录酶, 降解RNA DNA杂交体中的RNA 的能力较弱, 对热的稳定性较AMV反转录酶差
cDNA合成:
1. 总RNA
2. 底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP
3. 引物,起始DNA的合成, oligo(dT)
4. 逆转录酶
5. DEPC处理水
温浴 ，按试剂盒说明书。
第十九张，共六十一张，创建于2022年，星期二
3. 引物设计
特异性引物设计
Specific primer
简并引物设计
Degenerated primer
嵌套引物
Nested Primer
第二十张，共六十一张，创建于2022年，星期二
1）长度15~30 bp
2）AT:GC 约50%， 两引物Tm值接近，55~88℃之间。退火温度＝ Tm (4GC＋2AT)－5
3）引物3’末端以G/C结尾较好
4）不形成引物二聚体
5）特异性, 作BLAST搜索
6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子 的氨基酸放在3 ’端
7）逆向引物要用互补序列
引物设计原则
第二十一张，共六十一张，创建于2022年，星期二
1）特异性引物设计
基因序列已知时, 可以设计特异性引物
特异性引物：有准确的碱基序列
第二十二张，共六十一张，创建于2022年，星期二
第二十三张，共六十一张，创建于2022年，星期二
第二十四张，共六十一张，创建于2022年，星期二
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