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cytoscan assay 中文手册 CytoScan Assay 中文手册 gDNA ≥ 50ng/ μL 关于振荡: Mix :高速振荡 3 次,每次 1秒 Reagents :3 次,每次 1秒酶:快速振荡 1秒关于离心:板:除片段化步骤要求 4℃外,其余均室温, 2000rpm 离心1 分钟 Reagents 和酶:离心 3秒关于酶: 以下步骤用到的所有酶均到用时才能从冰箱拿出, 用完立即放回-20 ℃ Stage 1: 消化 gDNA 高速振荡 3 次,每次 1 秒混匀, 2000rpm 离心 1 分钟。 2. 10× Nsp I Buffer 和 100 × BSA 室温融化,振荡、离心,冰上放置。 3. Nsp I enzyme 放于-20 ℃,用时才能拿出来。 4. PCR 仪要先预热。 5. 阳性对照管(+) 加5μL Genomic DNA , 阴性对照管(-)加5μL low EDTA TE. Digestion Master Mix 。 Mix 振荡混匀并离心。 Mix 分管加至模板中。 PCR 板高速振荡 5 次,每次 1 秒; 2000rpm 离心 1min 。 10. 按上图右侧的程序运行。 Stage 2 :连接 1 .预热 PCR 仪,将板放于室温。 2. 10× T4 DNA Ligase Buffer( 约 20min) 和 50μM Adaptor,Nsp I 室温融化,振荡混匀, buffer 变清澈,离心,冰上放置。 3 .消化后的模板 2000rpm 离心 1min ,冰上放置。 4 .配 Ligation Master Mix. 5. Mix 高速振荡 3 次,每次 1 秒;离心 3 秒。 6 .将连接 Mix 分至各消化管。 7 .将 PCR 板高速振荡 5 次,每次 1 秒; 2000rpm 离心 1min 。 8 .按上图右侧的程序运行。 Stage 3A : PCR 1. 连接产物盖紧盖口, 2000rpm 离心 1min 。 2. 稀释连接产物。 3. 盖紧盖口,高速振荡 5 次, 2000rpm 离心 1min ,冰上放置。 4. 稀释后的 PCR 产物每个模板分成 4 管,每管 10μL 。如下图 5. PCR 仪预热。 6. 10× TITANIUM Taq PCR Buffer, d NTP Mixture, PCR Primer 002 室温融化,混匀并离心,立即置于冰上。 GC-Melt Reagent 和 Affymetrix Nuclease-Free water 置于冰上。 master mix 。 8. 高速振荡 3 次,每次 1 秒。 master mix 分装至各管。 10. 高速振荡 5 次,每次 1 秒。重复振荡一次, 2000rpm 离心 1min 。 11. 按上图右侧的程序运行。此步 PCR 一定要用银质板或金包银板的 PCR 仪。 Stage 3B: PCR 产物验证 L的 PCR管, 各加入5μL的 Affymetrix? Nuclease-Free wate r 和2μ L的 USB 5× RapidRun? Loading Dye 。 2. 从第一排的 PCR 产物中各抽取 3