实验设计及技术路线.docx

竞赛设计及技术路线
争辩目的
本课题针对严峻影响植物生长的安全因素——软腐害，在前期课题组争辩植物生物防治和保护的根底上，选取南方红豆杉为争辩材料，通过对南方红豆杉内生菌进展分别和纯化，进一步通过拮抗试验，探究其对半夏软腐病 NA 培育基外表 5min 后，将培育皿于 30℃培育 3-5 天，观看微生物生长状况。②消毒液涂板法：将外表消毒的最终一次冲洗液涂布于 NA 平板上，于 30℃ 培育 3-5 天，观看微生物生长状况。假设有菌生长，说明外表消毒不彻底。两种检测方法均证明以上样品处理和消毒方法可行。
内生菌分别
内生细菌、放线菌分别：样品外表消毒、晾干后转入加有9mL 无菌水无菌研钵中研磨匀浆，取原液、稀释 10 倍液和 100 倍液，然后分别涂于 NA/高氏 1 号平板上,每个稀释度设 3 个重复，平板倒置在 28℃的培育箱内培育。细菌培育24h，放线菌培育 7-10d。
内生真菌分别：在无菌操作台上将消毒后的材料用无菌刀切成小块，茎、根：长度 2cm 左右，等距离均匀放置于含有链霉素浓度为 30mg/L 的 PDA 平板培育基上(3-4 片/皿)，设置 3 个重复，在 28℃的培育箱内倒置培育 5-7d。
细菌、真菌、放线菌的纯化和保存
挑取平板上不同外表形态的细菌、真菌、放线菌单菌落，分别在NA/PDA/高氏平板上划线培育、分别、纯化，然后将纯化的菌株转接到相应的试管斜面培育基于 4℃保存。
拮抗菌初筛
拮抗细菌的平板初筛承受滤纸片法和打孔法，拮抗真菌、放线菌承受对峙培育法。
拮抗细菌筛选
①滤纸片法：病原菌接种在牛肉膏蛋白陈琼脂培育基上，28℃培育 24h 后，用无菌水制成菌悬液备用。稀释病原菌悬液浓度为 104-105cfu/ml 的菌液，然后吸取100μl 病原菌液涂NA 平板，在涂好的平板上均匀的粘上直径为 7mm 的滤纸三片， 每片滤纸上点接上 10μl 的供试菌〔浓度约为 108cfu/ml〕，每个处理三个重复，然后置于 28℃的培育箱中培育 24h，观看是否有抑菌圈消灭，并记录抑菌圈大小。
拮抗真菌筛选
①病原菌及供试真菌的培育：病原菌接种在牛肉膏蛋白陈琼脂培育基上，28℃培育 24h 后，用无菌水制成菌悬液备用。纯化真菌接种到 PDA 培育基平板上，28℃ 培育 3-5d。
②拮抗性测定：在 PDA 平板上中心位置上点接上供试真菌，倒置于 28℃培育箱中培育 2 天,然后在供试真菌的四周涂布病原菌液〔浓度为 104-105cfu/ml〕，最终倒置平板于 28℃培育箱中培育，观看抑菌带的产生状况，并做相应记录。
拮抗放线菌筛选
①病原菌及供试放线菌的培育:病原菌接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培育基上，28℃ 培育 24h 后，用无菌水制成菌悬液备用。纯化放线菌接种到高氏一号培育基平板上，28℃培育 5-7d，制成菌饼(7mm)备用。
②拮抗性测定:首先在NA 平板中心位置接入培育 5-7 天的放线菌菌饼，置于 28℃ 培育箱中培育 3 天，然后在菌饼四周均匀涂布培育 24h 的病原菌液〔浓度为104-105cfu/ml〕，然后平板置于 28℃培育箱中培育 1-2 天，观看抑菌状况，并做
相应记录。
技术路线
选取南方红豆杉根、茎、叶等颖组织
实行不同的分别方法对南方红豆杉内