大肠杆菌质粒DNA的提取.pdf

4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入 12ml 新配制的溶液 II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰
浴 10 15 年里已成功地设计了形形
色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是
Walter Schaffner 发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，
则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲
液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液
倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
通贯凝胶的电场接通后，在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移。
（3）琼脂糖凝胶的染色
电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含 EB 的染液中，染色 10 分钟，取出紫外灯下观察。

三、大肠秆菌感受态细胞的制备
感受态的细胞可以摄入外部溶液中的 DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒
DNA 进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
1、取 1%大肠杆菌 接种于含 2ml LB 培养基的试管中，37℃振荡培养过夜
2、取 过夜培养物转种于含 10ml LB 培养基的三角瓶中，37℃振荡培养 3h 至
OD600=
3、然后把培养物倒入 离心管中，冰浴 10min。
4、在 4℃下以 4000rpm 离心 5min，去上清液5、把菌体悬浮于 15m1 冰冷的 CaCl2 溶液中，置冰上 30min
6、然后再在 4℃下以 4000rpm 离心 10min，去上清液
7、将菌体悬浮于 CaCl2 溶液中，冰浴放置 4-12hr 备用。

四、质粒 DNA 高频转化大肠杆菌
制备好感受态细胞后，接下来就是质粒 DNA 转化入大肠杆菌细胞的过程。但要注意的
是感受态细胞最好是新制备的，因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低；此外 DNA
的浓度也要注意，不能太高。
1、取新制备的一管感受态细胞。
2、取 0．03ml 感受态细胞转和 4ng 质粒 DNA 混匀，置冰浴 30min
3、将 Ep 管置于 42℃水浴中热冲击 2 分钟，立即置于冰上 1 分钟。
4、在 Ep 管中加 70u1 LB 培养基混匀，37℃培养