过氧亚硝基阴离子调控谷氨酸脱氢酶的催化功能的论文.doc

过氧亚硝基阴离子调控谷氨酸脱氢酶的催化功能的论文.doc过氧亚硝基阴离子调控谷氨酸脱氢酶的催化功能的论文


【摘要】目的: 观察过氧亚硝基阴离子(onoo-)对谷氨酸脱氢酶(gdh)的硝基化修饰及功能调控. 方法: gdh与onoo-体外反应,测定酶活性及别构调节效应,ol/l onoo-不影响 gdh活性和二磷酸腺苷(adp)别构激活作用,但使三磷酸鸟苷(gtp, 10 μmol/l)别构抑制作用由(49±4)%降低至(69±7)%和(75±3)%;36~108 μmol/l onoo-使gdh活性由(±) kat/kg降低至(±)和(±) kat/kg,使gtp(10 μmol/l)别构抑制作用降低至(83±4)%和(95±7)%;324 μmol/l onoo-使gdh完全失活. ate dehydrogenase,gdh)催化l谷氨酸与α酮戊二酸相互转化,是联系氨基酸和糖代谢的枢纽. gdh在细胞内可能会发生酪氨酸硝基化修饰[1],但该修饰对酶催化功能的影响尚少见报道. 鉴于体内蛋白硝基化主要通过过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, onoo-)介导[2],同时gdh催化功能被别构激活剂二磷酸腺苷(adenosine 5′diphosphate, adp)和抑制剂三磷酸鸟苷(guanosine 5′triphosphate, gtp)调节[3],本研究观察onoo-对gdh催化活性和别构调节的影响.
1材料和方法
(type i, ammonium sulfate suspension, ≥40 units/mg protein),还原型辅酶i(βnadh),α酮戊二酸,脂多糖(from escherichia coli 055:b5) (美国sigma公司);抗硝基化蛋白mab(antinitrotyrosine, antint,美国cayman chemical公司);硫酸铵,adp,gtp(美国amresco公司);smartspec 3000型分光光度计(美国biorad公司).

-合成与定量硝酸化的双氧水与亚硝酸钠,以三通管迅速推入氢氧化钠溶液,得黄色产物, (mmol/l)-1 ·cm-1定量[4].
-反应gdh透析除去硫酸铵, mg/ml,取300 ml离心管,另取1 μl onoo-置于离心管内壁,使反应体系中onoo-的终浓度为0,4,12,36,108和324
μmol/l,快速震荡10 s,加入300 μl缓冲液终止反应,立即进行酶活性测定和硝基化修饰检测.
[5]的方法进行测定,反应体系为250 μl,包含50 mmol/l磷酸钠缓冲液(ph ), 50 mmol/l硫酸铵, 160 μmol/l βnadh, 5 mmol/l α酮戊二酸和5 μl gdh酶溶液;记录3 min内340 nm吸光度改变量. 以β (mmol/l)-1·cm-1 计算底物消耗速率,由公式[(△a 340 nm/min)/]×250 μl×10-3÷