6 流式细胞术的质量控制 和影响因素 PPT课件.ppt

流式细胞术的质量控制和影响因素
一、标本的采集和固定方法的质量控制

标本采集是十分重要的环节,在标本的采集过程,需注意:
①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,要避免出血坏死组织。
②标本采集后要及时固定或深低温保存,以免组织发生自溶,DNA降解,而造成测试结果的误差。
③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。
例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好,因为高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜,致使细胞内的物质固定不良。

有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响,发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体,且不固定的组织细胞随时间的延长,DNA含量呈梯度降低
根据检测的目的,选择什么类型的固定剂,对流式检测质量也有显著的影响。
例如细胞DNA的分析,使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂,醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。实验证明,醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用,其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。
如果作流式免疫研究工作,采用新鲜组织是最好的选择。在不能及时检测又没有低温保存条件时,要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面,在膜表面的抗原物质,以醛类固定剂为宜,尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强,但不宜采用醇类固定剂,因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失,失去标记的位点。
如所测抗原物质在细胞内,可以使用醇类固定剂,这种固定方法简便易行,无需特殊低温冷冻条件,在一般冰箱(0-4℃)放置即可,能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。
二、单细胞悬液制备的质量控制

人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织,尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料,其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态,它是流式分析最合适的样品来源。
二、单细胞悬液制备的质量控制

全血中含有多种有形成分,流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象,因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来。例如,以淋巴细胞DNA定量分析为例,就须把淋巴细胞分离出来,而将其他有核细胞或红细胞去除,对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤,出现血小板凝集
新鲜实体组织单细胞样品的制备,实体组织是流式分析工作的主要材料来源,但对其分散单细胞样品的技术和方法,仍存在着很多问题,仍需大量的探索工作。就目前,国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法,甚至同样组织,用于不同的实验目的,就需要不同的方法处理,或者每一种组织就是一个单独的问题
因此必须根据实际情况,去选择合适有效的单分散方法,选用的方法必须达到细胞产量高,细胞损伤小的目标,但实际工作中达到这个目标是困难的,多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法,化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等,根据各种组织的特点,以及实验目的的不同,可选择不同的方法。