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超高分辨率显微镜(建议用Word2016打开)
超高分辨率显微镜
学习报告
地空学院
赵思源
电子显微镜以及 Binning 和 Rohrer 的扫描隧道显微镜获得 1986 年无法区分它们。因此，生物学研究迫切地需要“突破”衍射极限的超高分辨率显微成像技术。
2 “突破”光学显微成像的衍射极限
实际上，衍射极限是一种远场(far-field) 效应，在近场(near-field) 条件下无效。因此早期的一些尝试突破光学衍射极限的努力都是基于近场光学成像的。像这次诺贝尔奖得主 Eric Betzig 就早在 1993年发展了扫描近场光学显微镜，首次实现了室温下的单分子超分辨率成
像。然而，近场光学显微镜无法用于细胞内部的成像，因此在生物领域的应用一直没有发展起来。后期的各种“突破”光学衍射极限的努力都是在远场条件下发展起来的。超高分辨率显微成像一般指在远场条件下基于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技术。荧光是物质吸收光照后发出的一类光。物质分子中的电子分布在不同的能级上。当一束光打到分子，分子具有一定的概率吸收光子，同时其处在基态的电子会跃迁到更高能量的激发态能级。处在激发态的电子有多种途径回到基态，其中一条途径就是发出一个光子(荧光) ，释放能量回到基态。发射光子的能量小于被吸收的光子，因此荧光的波长比激发光的波长要长。荧光显微镜利用了荧光发射光波长比吸收光波长较长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和发射光，大幅降低了成像的背景。结合灵敏的检测器件，在优化条件下，荧光
显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山。除了低背景和高灵敏度，荧光显微镜还通过对特定分子进行标记，具备很高的特异性。这一系列特点使得荧光显微镜成为生物学研究中最常用的一种光学显微镜。
超高分辨率荧光显微技术通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使我们能以前所未有的视角观察生物微观世界。目前的超高分辨率荧光显微技术大体可分为两类，一类通过调制照明光斑缩小系统的点扩散函数来实现超分辨成像，主要贡献者包括这次诺贝尔奖得主 Stefan Hell 以及 Mats Gustafsson; 另一类则是基于单分子定位的超分辨技术，主要贡献者包括这次诺贝尔奖得主 Eric Betzig、W．E．Moerner 以及哈佛大学庄小威教授和
Samuel Hess。
2． 1 基于点扩散函数调制的超分辨技术
此次获奖的德国科学家 Stefan Hell 现为德国哥廷根大学教授和德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。他在1994 年还在做博士后的时候就最先提出了受激发射损耗的方法(stimulated emission depletion，简称 STED) 来打破光学衍射极限。其原理非常朴素但却十分巧妙。前面提到由于衍射极限的存在，光束聚焦的光斑尺寸不能无穷小，而是限定为光的波长的一半，这对应了荧光显微镜中聚焦激光光斑的点扩散函数。理论上，如果能缩小激光光斑就可以实现超分辨成像。Hell 的基本想法是在激发光斑点扩散函数周围套上一个环形点扩散函数，以“擦除”激发光斑的外围，从而使得激发光斑“变小”(图4) 。在这里，Hell 利用
了产生激光的受激辐射原理，用位相板产生环状的激光光斑并套在激发光斑外。这个环状光的波长匹配激发态到基态的能量差，同时功率够高，使得其区域内处在激发态的荧光分子在环状光照射下会发生整齐划一的饱和受激辐射。因为受激辐射波长与自发辐射( 荧光) 不同，所以环状光覆盖的受激辐射可以被挡住，而环内的自发辐射则是我们需要的荧光。由于环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小，这样就可以获得一个小于衍射极限的荧光激发点。这样，Hell 的方法就更改了 Abbe 的衍射极限公式:
d=λ2nsinθ1+I/lIs (2)
式中 Is 是饱和受激辐射的激光强度，I 是环状光的强度。可见，随着 I 的增加，STED 技术的分辨率可以无穷小。
这个巧妙的思想在技术实现上当时是非常困难的。Hell 经过多年坚韧的努力，终于在 2000
年实现了他在 1994 年提出的这个想法。他用一束激光激发荧光分子发光，再用另一束环状激光消除激发光周边的荧光，通过二维点扫描实现了超高分辨率成像，将光学显微镜分辨率提高了近 10 倍。然而由于荧光分子一般饱和光强较高，可达 100MW/cm2，因此环状光需要极高的功率，大大加重了样品的光损伤和光漂白，制约了 STED 技术在生物中的应用。从 2000 年开始，Hell 的团队不断