《鸡胚接种技术》.ppt

第二章 鸡胚接种技术
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一、概况
1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。
1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次体。用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。
~，然后将旋转鸡胚使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。
在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在上的位置，33~35℃继续培养48～72h。
接种步骤与方法
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绒毛尿囊膜接种法
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解剖与收获
用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用50％甘油保存。同时作无菌培养。
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（三）尿囊腔接种
广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养，这些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。
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取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用开孔器钻开一长约2mm小口。
再次消毒钻孔区，～，将针头刺入孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。
消毒后用石蜡溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～72h，；于接种后24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。
接种步骤与方法
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尿囊腔接种法
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解剖与收获
接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养44～48h，乙型流感病毒培养72h。
收获前鸡胚置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长。
消毒气室的卵壳，用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳，用无菌镊子撕去气室部壳膜，并翻开到卵壳边上。
将鸡卵倾向胚胎一侧，用灭菌毛细吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸出尿囊液。一般一个鸡胚可收获5～10ml的尿囊液。
若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液则无。经无菌试验后，可在4℃或低温保存。
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（四）卵黄囊接种
主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖。这些大的病原体主要在卵黄囊的内皮细胞生长，且生长速度很快，立克次体染色后也可看到。
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取5～8日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，钝端朝上，消毒气室端。
用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有6号针头的1m1注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约3cm，～，随后用胶带或溶化的石蜡封孔。
置孵化箱内继续孵育3～8d，时间长短应根据病毒或立克次体的种类而定，每天翻卵2次，弃掉24h内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡)。
接种步骤与方法
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卵黄囊接种法
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解剖与收获
收获时，鸡卵预冷，消毒气室端的卵壳，剪掉卵壳，除去壳膜后，用镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开。
夹出卵黄囊放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入平皿中，然后剥出卵黄囊。
将不带卵黄的膜放在无菌平皿或烧杯中，以便用于染色检查或进行传代。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。
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三、注意事项
防止污染：鸡胚为一活的有机体，因此
要严格无菌操作。
动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。
适宜的培养温度：
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第四节 病毒的检测
无菌试验
— 目的:证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染。
— 方法:
收集鸡胚组织接种肉汤培养；
37℃培养36h；
肉汤清亮则无污染,肉汤浑浊或有菌落,说明鸡
胚被细菌污染。
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直接观察法
— 在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹:如痘类病毒和
疱疹病毒,常产生白色或灰色痘疱,并有充血；
— 引起鸡胚死亡:如新城疫病毒、乙脑病毒；
— 造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓：马流感病毒。
实验检测法
— 血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；
— 补体结合试验：腮腺炎病毒；
— 其他方法：PCR等。
检测方法
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第五节 鸡胚接种技术的应用
病毒的培养、分离与鉴定
流感病毒的分离和鉴定
禽流感病毒的分离和鉴定
其他病毒的分离和鉴定
疫苗的研制
活疫苗和死疫苗
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第三章 动物试验技术
实验动物(experimental animals)：是指经人