一代测序规范操作规范.docx

Prepared on 22 November 2020
一代测序规范操作规范
PCR产物测序实验操作流程
实验试剂和耗材准备
（一）实验试剂
实验试剂
主要用途
核酸提取试
制冰
电冰箱
试剂的储存
高速台式离心机
试剂的离心
Mini式离心机
瞬离试剂
旋涡式混合振荡器
混匀试剂
电子分析天平
试剂的称量
核酸检测仪
核酸纯度和浓度的检测
PCR仪
PCR
电泳仪和水平电泳槽
琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪
核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析
基因分析仪
DNA的测序或片段分析
蒸汽式高压湿热消毒器
试剂、实验耗材及用具的消毒
电热鼓风干燥箱
实验用品的干燥
恒温水浴锅
提供恒温环境
三、实验操作具体步骤
（一）核酸的提取
按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。
（二）测序PCR模板的制备
（1）、预先制备适量冰
（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix
（3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上
成分
体积（20μl体系）
终浓度
Extender PCR-to-Gel Master Mix，2×
10μl
1×
10μM上游引物
μl
μM
10μM下游引物
μl
μM
50ng/μl的模板
μl
5-50ng
ddH2O
根据需要
—
（4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序
95℃ 5min→
（95℃ 30sec，67℃ 30sec - ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→
（95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→
72℃ 7min→4℃ Forever
（5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃ 消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：
PCR产物
5μl
Exo I
μl
碱性磷酸酶
1μl
（三）、纯化后的PCR产物的测序反应
1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数）
2、测序反应用引物稀释到1μM
（1）PCR产物测序反应体系（10μl）：
成分
加入量
纯化并稀释好的PCR产物
1μl（也可参考下表）
引物（上游或者下游）1μM
1μl
BigDye 10倍稀释
8μl
总体积
10μl
PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表：
DNA纯度：OD260/OD280=~；DNA含量（