实验十 pUC57 T载体的制备.docx

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实验十pUC57T载体的制备
．原理
PCR产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上的一些技术问题可能限制其应用。由于PCR产物3'末端突出一个A,因此克隆PCR产物的载体3'末端必须突出一个T(2J1：1),振摇30秒，12OOOg离心2min，移上层水相至另新管中。
用琼脂糖凝胶电泳除掉未连接的限制酶接头片段，从胶中川收DNA片段。
将5'突出末端转变为平端的方法
试剂'
无核酸酶重蒸水
限制性内切酶及其缓冲液
氯仿：异戊醇(2/1：1)
TE缓冲液
10mmol／LTris-HCl
lmmol/LEDTA
酚：氯仿；异戊醉(24:1)
3mol/L乙酸钠，
无水乙醇
70%乙醇
DNA聚合酶大片段(Klenow)
10XDNA聚合酶Klenow片段缓冲液
500mmol/LTris—HCl，
100mmol/LMgSO
4
lmmol/LDTF
T4DNA聚合酶
10xT4DNA聚合酶缓冲液
330mmol/LTris—
660mmol/L乙酸钾
100mmol/L乙酸镁
5mmol/LDDT
乙酰化牛血清白蛋白，1mg/ml

原理Klenow(DNA聚合酶大片段)及T4DNA聚合酶都能利用dNTPs补齐5'突出末端
Klenow聚合酶法
、突出末端。
加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到反应管中提取DNA,振摇1分钟，12000g离心5分钟。
转移上层水相至另一新离心管中，为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。
，冰上或-20C放置15〜30分钟，沉淀
DNA。
4°，小于100ng/ml，离心时间为30分钟这样可增加
DNA的回收率。
注：小量DNA的回收也可通过加入核酸如酵母DNA到样品中，使其终浓度达50pg/ml,而改进回收效果。如果tRNA会影响以后DNA的应用，也可使用糖原。
%乙醇。12OOOg4C离心5分钟。
小心移去上清，空气中干燥沉淀。
用含：40pmol/。总反应体积在10一100之间均可。
KlcnowDNA聚合酶在许多限制酶反应缓冲液中(如Promemt的核心缓冲液)有一定活性。这样可直接将酶及40pmol/L每种dNTP加入到限制酶反应后的反应管中，省略以上的①〜⑦步。
将反应管置室温中反应10分钟
75C作用10分钟终止反应。
(2)T4DNA聚合酶法
采用Klenow聚合酶法的①一⑦步骤纯化DNA。
用含100pmol/。每微克DNA加5uT4DNA聚合酶
75C作用10分钟终止反应。
3•将3'突出末端转变为平端的方法
(1)试剂
无核酸酶重蒸水
限制性内切酶及其缓冲液
氯仿：异戊醇(24：1)
TE缓冲液
lOmmol