PEG诱导细胞融合.pptx

PEG诱导细胞融合
李卓
王慧琴
杨佳慧
王钟秀
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细胞融合
自发条件下或人工诱导下，两个或两个以上的同种基因型或异种基因型的细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合，也称细胞杂交。
同种细胞能够自发融合，是机体976 年Dudus等报道人的细胞能和胡萝卜的原生质体发生融合。Davey ( 1972 年)和Vasil( 1977 年)用植物原生质体摄取了细菌细胞。
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1975 年，在动物体细胞杂交技术的根底上又创立了淋巴细胞杂交瘤技术。同体细胞融合一样, 杂交瘤工作早期使用的促融剂——灭活的仙台病毒, 已逐渐为化学促融剂PEG 所取代。Davidson 等于1976年建立的以PEG诱发哺乳类细胞融合的方法, 也同样适用于淋巴细胞同瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术能制备纯度高、专一性强的抗体,适于由未纯化的抗原大量制备,因而在短短几年时间里,即已被广泛用于制备各种单克隆抗体。
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PEG诱导细胞融合
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PEG作用机制
聚乙二醇〔PEG〕是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG是一种特殊的脱水剂，可与水借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，使细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间外表张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
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PEG的最适使用条件
细胞的融合效果与PEG的相对分子质量及其体积分数成正比，但PEG的相对分子质量越大、体积分数越高，对细胞的毒性也就越大。实验时常选用PEG相对分子质量为4000-6000，体积分数为50%时，细胞破碎较少，融合率较高。
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其他影响细胞融合的因素
钙离子可以使带微弱负电荷的PEG与细胞膜外表分子相互作用，引起细胞膜外表电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个细胞全部融合。当钙离子浓度为50mmol/ml时，融合效果最好。
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实验结果：
观察到两个或多个
细胞发生质膜融合
但核尚未融合，有
的那么是细胞间不仅
发生质膜融合，而
且细胞核也发生了
融合。
刚开始融合
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开始进行核融合
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分析讨论
聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。
由实验结果可得，鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率还是不错的。经分析主要是以下原因：
由于PEG与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜， PEG与鸡血红细胞充分接触，从而融合率比较高。
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实验本卷须知：
1. 由于离心时红细胞的数量很少，吸取的时候要小心，尽量把吸附在管壁上的红细胞都吸出来。此外吸取的动作不能太大，否那么会破坏离心形成的分层。
2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否那么会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或者细胞膜破裂导致细胞质外泄。
3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚融合的细胞分开。
4. 加PEG应该在37ºC水浴加，这样可以防止PEG凝固，导致离心失败。
5. 注意每次离心的时间和速度，否那么得不到想要的红细胞。
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新的细胞融合方法
细胞融合技术在生物科学各领域取得进展的同时,从事细胞融合研究的科学工作者一直没有放弃寻找具有更高融合效率的方法。虽然用PEG 作介质诱导细胞融合具有上述优点,但PEG 诱导细胞融合也存在一些内在的问题,如PEG 在有效的浓度范围内( 50 % ～55 % )对细胞毒性很大,因此人们又试图寻找新的方法来替代PEG 介导细胞融合法。
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①电脉冲诱导细胞融合技术　
②激光融合技术
③空间细胞融合技术　
④离子束细胞融合技术　
⑤非对称细胞融合技术　
纵观细胞融合技术的开展历史, 细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上, 另一方面表达在新方法上, 再者表达在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒,灭活病毒生物阶段到PEG 化学物质阶段; 新方法不断涌现, 从生物学, 化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生物,从种内扩展到种间,