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细胞支原体污染
较长一段时间,一直觉得细胞培养有点问题,无缘无故的出现细胞代谢异常现象,培养基内小渣渣变多,看不到细菌污染,看不到培养基浑浊,但可以感觉到细胞状态不行,即使是单层没有复层时也一样,当时考虑支原体污染,查了一些有关支原体污染细胞支原体污染
较长一段时间,一直觉得细胞培养有点问题,无缘无故的出现细胞代谢异常现象,培养基内小渣渣变多,看不到细菌污染,看不到培养基浑浊,但可以感觉到细胞状态不行,即使是单层没有复层时也一样,当时考虑支原体污染,查了一些有关支原体污染的内容,由于细胞状态可以在换新鲜培养基的时候转变过来,而自己的实验也是需要在换培养基后进行,故而疏忽了可恶的支原体污染,今天决定解决这个问题。
先查了一下资料:
细胞支原体污染的一般情况及预防措施
细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时,会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时,较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时,细胞之外观较无明显变化,但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表,如下:
国家受支原体污染(%)报告年度
USA—FDA151993(past30years)
USA-ATCC15-201992
Japan—(IFO,RIKEN,JCR80~30~2219811987-19931998
Germany—DSM361990-1994
Argentina651987
Israel321986-1993
China951990
造成支原体高污染率的原因
1、~,无细胞壁,可透过一般过滤膜(-)
2、 支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3、 过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4、 细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染
5、研究或操作人员忽略污染问题
支原体污染的来源
1、 已受污染的细胞
2、 操作人员的疏失
3、 已受污染的培养基、血清
4、操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛,实验室之操作人员的污染亦可能为污染源,须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时,最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃,以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染,有以下几种方法,只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染
1、 抗生素处理:BM-cyclin(Roche),MRA(mycoplasmaremovalagent,ICN),Ciprofloxcin(Bayer),Enrofloxacin(Bayer)
2、 Nucleicacidmetabolites:5-bromouracil,Hoechst33258,bromodeoxyuridine
3、Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意:
设备方面:
1、 使用已作支原体测试ok之细胞株
2、 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面:定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染的Q&A
1、 应如何避免细胞污染?
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
2、 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
直接灭菌后丢弃之。
3、 支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
4、 支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
5、 侦测出细胞株有支原体污染时,该如何处理?
直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。
支原体之检测
相差显微境检测
将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上,24h后取出,。
此处缺一张400倍倒置相差显微镜图片,准备在鉴定完成后用自己实验中的图片补充。
据目前所见可以表现为培养液中可见一类黑、白色小虫(可能是由于光源的问题),镜下快速运动,单个不成串。与布朗运动不同。
电镜检测
扫描电镜的支原体阳性检出率高于透射电镜,可能由于支原体