植物生理指标测定.docx

实验22过氧化物酶活性的测定
过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验实验22过氧化物酶活性的测定
过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用,掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。
一、原理
在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收,故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
马铃薯块茎。
(二)仪器设备
722型分光光度计,离心机,研钵,容量瓶,量筒,试管,吸管。
(三)试剂
(1).的磷酸缓冲液。(2)。
⑶2%H202。(4)20%三氯乙酸。
三、实验步骤
(一)酶液的制备
,切碎放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10min,上清被转人25mL,容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次,上清液并人容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。
(二)过氧化物酶活性测定
酶活性测定的反应体系包括:;%H2O2;。用加热煮沸5min的酶成为对照,反应体系加人酶液后,,%三氯乙酸终止反应,然后,过虑(或5000xg离心10min),。
四、结果计算
(u)。
过氧化物酶活性二上470江[u/()]

式中:AA47o为反应时间内吸光度的变化:;t为反应时间,mins;VT为提取酶液总体积,ml;Vs为测定时取用酶液体积,mL。
实验24超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
(氮蓝四唑光化还原法)
一、原理
超氧物歧化酶(Superxidedismtae,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基(02的酶,它催化下列反应:2O2+2H+*H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢
酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,02可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除02,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
水稻或小麦叶片。
(二)仪器设备
分光光度计,高速台式离心机,研钵,容量瓶,量筒,试管,吸管,荧光灯。
(三)试剂的配制
(1)(PBS,):
A母液::取Na2HPO4^12H2O();
B母液::()。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
()的配制:分别取A母液(Na2HPO4),B母液(NaH2PO4),用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)
(2)130mmol/L甲硫氨酸溶液:()定容至100ml。
(3)100umol/LEDTA-Na2溶液:-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
(4)20^M核黄素溶液:,避光保存。
(5)750umol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:。
三、实验步骤
酶液制备:取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。--2ml于1000r/mi