蛋白质组研究技术的应用.ppt

蛋白质组研究技术的应用:未知蛋白质的分离与鉴定
中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心(RCPA)
Research Center for Proteome Analysis
Shanghai Institutes for Biological Sciences
Chinese Academy of Sciences
蛋白质组学技术
样品制备
双向凝胶电泳
蛋白质差别点分析
胶内酶解
质谱分析
数据库检索
经典蛋白质分析技术
目标蛋白质的分离
目标蛋白质的纯化
蛋白质理化性质的分析(分子量、等电点)
蛋白质测序(N、C端测序)
蛋白质组研究与蛋白质研究方法对比
研究策略整体 vs. 个体
落实到蛋白质组中的单个蛋白质成分的研究技术,并没有脱离蛋白质研究的基本框架。
蛋白质组学大规模技术的发展必然促进了对单个蛋白质的研究。
很多在单个蛋白质研究中得以应用的技术也很快应用到蛋白质组学研究中。
Mass Spectrometry
Protein Separation
Data Processing
Protein Expression
Protein Function
Drug Development
Clinical Trials/Diagnosis
Drug Target/Biomarker Discovery and validation
蛋白质组学技术—样品全息制备
蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步。

针对不同来源的样品(如细胞,动物组织,植物,体液等),需要采取不同的蛋白质抽提方法。
样品制备或样品的预处理已经成为蛋白质组学研究的一个瓶颈,对研究者提出了更高的要求。
理想样品需满足的要求
在适合的盐浓度下,可重复溶解所有的蛋白质
避免溶解度低的蛋白质在等电聚焦时沉淀析出
防止蛋白质化学修饰,包括蛋白质降解,蛋白酶或尿素热分解后引起的修饰
排除核酸,脂类和其他干扰分子
获得的目标蛋白质应在可探测水平,有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质
蛋白质组学技术—样品全息制备
样品制备的步骤
细胞破碎
蛋白沉淀
蛋白溶解
抑制蛋白酶活力
去除
--- 核酸,脂类
--- 盐类,缓冲液,离子,小分子
--- 不溶物
蛋白质组学技术—样品全息制备
双向凝胶电泳常规样品制备实例
常规细胞培养,待长至80%左右密度时,在处理前一天更换新鲜培养液
吸去培养液,用预冷PBS清洗细胞,重复3次
1×106细胞加50μL,往培养皿中加裂解液(8mol/L Urea,4%CHAPS,40mmol/L Tris,65mmol/L DTT),刮刀收集
进行超声波处理,处理时间为5s,间歇时间为10s,功率在100-120W之间,超声处理至溶液清澈无粘稠物为止
4℃ 25 000g 离心1小时
取上清测蛋白质浓度后,分装后-70℃冰箱中冻存
蛋白质组学技术—样品全息制备
不同来源样品处理方案
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳是蛋白质组学中对蛋白质进行研究的主要分离方法,是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。
基本原理
根据蛋白质的等电点(第一向)和分子量(第二向)的不同进行分离。
电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色,然后用相关软件对电泳图象进行分析。
蛋白质组学技术--双向电泳