血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量-实验报告.doc

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生物化学实验报告
姓名:
学号:
专业年级:
组别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
预测血清蛋白电泳区带图
血清蛋白依次分为清蛋白,球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带
.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比;③可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中;④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。
三、材料与方法:
:
:①样品:健康人血清(新鲜、无溶血);②巴比妥-巴比妥钠缓冲液(,);③氨基黑10B染色液;④漂洗液;⑤洗脱液:。
:①V-1100分光光度计(×1);②恒温水浴箱(×1);③试管(×6)、试管架(×1);④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120μm);⑥培养皿(×5);⑦点样器或载玻片(×1);⑧平头镊子(×2);⑨剪刀(×1);⑩电泳槽(×1);⑪直流稳压电泳仪(×1)

准备与点样:①取2×8cm的膜条;②;③充分浸透在巴比妥缓冲液中;④取出膜条,用滤纸吸去多余的缓冲液;⑤点样器下端粘上薄层血清;⑥垂直点样。
点样示意图:
注意:点样线尽量点得细窄而均匀。
+
——
8cmm
2cm
点样线
点样区

(粗面)
小组标记
样品标记
电泳:①放置膜条(点样面向下,点样端置于阴极);②膜条贴紧滤纸,拉直膜条;③平衡五分钟;④通电(调节电压120v/电流,时间:45~60min);③关闭电源。
电泳槽解剖图:
、漂洗:①通电完毕;②取出膜条;③浸于染色液(氨基黑10B)中,5min;④取出膜条,浸于漂洗液;⑤反复漂洗2次,直至漂净;⑥滤纸吸干薄膜。
(洗脱比色法)(因实验室等原因,未做)
四、结果与讨论:
图一染色后的膜条

本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和γ-球蛋白的区带,其余无法区别。原因可能如下:
①醋酸纤维薄膜质量不足
②薄膜过湿,样品扩散迅速,导致样品分离不成区带。
③点样太少,区带显色不明显。
④电泳时间不足。
⑤薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。
⑤取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。
⑥染色时,因为现场混乱,可能导致醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的,在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。

电泳时,点样端置于电场的正极还是负极?为什么?
答:点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电,要成功分离出各类各类蛋白质,理应将点样端置于电场的负极。
电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。
答:①醋酸纤维薄膜质量不足;②薄膜过湿,样品扩散迅速,导致样品分离不成区带;③点样太少,区带显色不明显;④染色时,醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的,在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。