细胞生物学综合实验报告.doc

本科学生实验报告

姓名学院_生命科学学院_
专业_ 班级_10B班_
实验课程名称_人类淋巴细胞株的培养_
指导教师及职称许琳峰_
开课时间 2012 至_2013 学年_上学期
云南师范大学教务处编印
实验名称:
人类淋巴细胞株的培养
实验时间:
——
实验室:
睿智楼3栋424
小组合作:
第四小组
实验主要内容:
1、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌)
2、培养基的配制
3、细胞传代培养
4、死活细胞的鉴别
一、实验目的
1、能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法。
2、熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。
3、熟练掌握细胞传代培养的操作方法,观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。
4、掌握死活细胞的鉴别原理及方法。
二、实验原理
1、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌)
(1)、清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤。
(2)、体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。
(3)、灭菌手段的选择也十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
培养基的配制
细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售,它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
细胞传代培养
当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定的密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞分散后,以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养,此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。
4、死活细胞的鉴别
细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活,最常用到的方法是染色排除法。
原理:许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内,却能渗入死亡的细胞内,使其着色,以次来区别死活细胞。
实验大体流程
细胞培养准备工作培养基的配制细胞传代培养死活细胞的鉴别
装置示意图
实验仪器,材料及试剂
工具
超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器
细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器()及注射器、离心管
微量加样器(移液枪)、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、血球计数板、滴管、显微镜、血球计数板
材料
微孔滤膜(直径25mm):、各种规格的Tip 、培养细胞、人类淋巴细胞株。
试剂
75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、
酚红、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3 、L-谷氨酰胺、三蒸水
台盼蓝(染料)、乙醇
:%台盼蓝溶液
六、实验步骤
清洗胶塞处理塑料制品的清洗 tip和tube的清洗洗液的配制消毒和灭菌化学消毒法准备(清洗与灭菌)
合成培养基的配制小牛血清的处理生长培养基的配制每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基没人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液放入二氧化碳培养箱,旋松瓶盖(直立放置)
取20ul细胞悬液放入干净的离心管中,%的台盼蓝染液混合,放置1min。取一干净的血球计数板,盖上盖片,从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡,也不能太多,否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。低倍镜下观察,活细胞不着色,台盼蓝着色的细胞呈深蓝色,是不健康或已死亡的细胞,不能计数。找出计数板上的方格,计算四角大格内总的细胞数,压着大格线者只计左侧或上方,不计右侧或下方。
七、实验操作方法
洗液的配制
常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度
成分
强酸洗液
次强酸洗液
重铬酸钾

315g
12g
600g
浓硫酸
100ml
5000ml
20ml
1000ml
蒸馏水
20ml
1000ml
100ml
5000ml
配制方法:
(1)将重铬酸钾放入大烧杯中,加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌,使重铬酸钾充分溶解。
(2)将重铬酸钾倒入酸缸中,然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌,充分溶解。
注意:操作时注意安全,穿戴好耐酸手套和围裙,防止