PDA培养基的配制方法计划.docx

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PDA培育基的配制方法
一、目的要求
。
。
二、培育基的配制原理
培育基是人工配制的各样营养物质供微生物生长生殖的基质,用以培育、分别、判定、
保留各样微生物或累积代谢产物。在自然界中,微生物种类众多,营养种类多样,加上实训
和研究的目的不同,所以培育基的种类好多,但无论是何种培育基,均应含有水分、碳源、
氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值要求不同样,所以配制培育基时,还应依据不
同微生物对pH值的要求,将培育基调到适合的pH值范围。
三、实训资料和器具
琼脂,可溶性淀粉,葡萄糖,10﹪NaOH,10﹪HCl,1mol/LNaOH,lmol/LHCl,KNO3,NaCl,
K2HPO4·3H20,MgSO4·7H20,FeSO4·7H2O;试管,三角瓶,烧杯,量筒,玻璃棒,天平,牛角匙,PH
试纸,棉花,牛皮纸,记号笔,纱布,
四、操作方法与步骤
(一)

培育基的配制
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PDA

培育基的配制

其配方以下:土豆

200g,葡萄糖

20g,琼脂

15~20g,水

1000mL,pH

值自然。
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(1)称量和熬煮

药品实质用量计算后,按培育基配方逐个称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中,加水
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1000ml,在加热器上加热至沸腾,保持

20-30min,用可用

2层纱布趁热在量杯上过滤,滤渣弃取。滤液增补
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水分到

1000ml。
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(2)加热溶解

把滤液放入锅中,加入葡萄糖

20g,琼脂

15~20g(提早搞碎),而后放在石棉网上,小
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火加热,并用玻棒不停搅拌,以防琼脂糊底或溢出,待琼脂完整溶解后,再增补水分至所需量。
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(3)分装

按实训要求,将配制的培育基分装入试管或

500ml

三角瓶内。分装时可用三角漏斗免得使培
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养基沾在管口或瓶口上造成污染。
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分装量:固体培育基约为试管高度的

1/5,灭菌后制成斜面,分装入三角瓶内以不超出其容积的一半为
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宜;半固体培育基以试管高度的

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1/3

为宜,灭菌后垂直待凝。
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(4)加棉塞

培育基分装完成后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞

(或泡沫塑料塞或试管帽等

),以阻挡
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外界微生物进入培育基内造成污染,并保证有优秀的通气性能。
包扎加塞后,将所有试管用麻绳或橡皮筋捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防备灭菌时冷凝水湿润棉塞,其外再用一道线绳或橡皮筋扎好,用记号笔注明培育基名称、组别、配制日期。
(二)棉塞的制作
棉塞的作用有二:一是防备杂菌污染;二是可过滤空气,保证通气优秀,并可减缓培育基水分的蒸发,所以
正确地制备棉塞是培育基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状、大小,松紧应与试管口(或三角烧瓶)完整适
合。过紧则阻碍空气流通,操作不便;过松时,空气会毫无阻碍地进入试管(或三角烧瓶)中,达不到灭菌的目
的。棉塞过小常常易掉进试管内,所以棉塞质量的好坏对实训的结果有很大的影响。正确的棉塞头较大,加塞
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时,应使棉塞长度的1/3留在试管口外,2/3在试管口内(见实训图6-4)。当前,有条件的实训室已使用牢固
的塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞代替棉塞,制作棉塞要选纤维较长的棉花,一般不采用脱脂棉。由于它
简单吸水变湿,造成污染,并且价钱也贵。棉塞制作方法见图6-5
实图6-4棉塞实图6-5棉塞的制作方法
(三)斜面与平板培育基的制作
斜面与平面培育基是常用的琼脂固体培育基。将熬制好的琼脂培育基趁热装入试管灭菌后摆鞋面,凝结
后即成斜面培育基。斜面培育基常用于菌种培育、菌种收藏等工作。将灭菌后的琼脂培育基倾注于无菌培育
皿中,凝结后即成平板培育基。平板培育基常用于分别菌种、菌落计数、菌落形态察看及菌种判定等。斜面
与平板培育基的制作过程大概为:溶解原料、消融琼脂、调PH、分装、灭菌和制斜面或平板。
1、溶解原料
为加快原料的溶解,最好用热水。先将原料挨次加入到占配制量一半的水中,待所有溶解后在加足水
量。如配方中有马铃薯、麸皮、胡罗卜、豆芽等天然原料,需将其熬限制30min,拿出定量滤液,在将所需
的其余原料加入滤液中。
、消融琼脂
琼脂的用量可灵巧掌握。用作收藏菌种的培育基,%,以增添持水性。冬天
的气温低,琼脂用量可适合减少。琼脂用前可剪成小段,以利于消融。待溶液煮沸是再加入,不停搅拌至
完整无琼脂块状物时再停止加热。
、调整PH
用干净干燥的玻璃棒沾一点培育基滴在试纸上,立刻与比色板比较。一般用10%NaOH或HCl调理。
、分装
将培育基趁热倒入垫有纱布的漏斗中,使培育基直接滤至试管或三角瓶中,试管装量一般为管高的1/4
左右,三角瓶的装量约为其容量的一半。勿使培育基玷辱容器口部。口部塞有棉塞,试管每7或9支扎一
捆,棉塞外面包牛皮纸,以防在灭菌过程中被水汽打湿。
5、灭菌
分装后的培育基应随即灭菌。除特别状况外,一般培育基均用高压蒸汽灭菌,在104kPa压力下,灭菌
20-30min。
6、制作斜面或平板
将灭菌后的试管趁热斜置于棍条上,倾斜度以试管中的培育基约占试管长度的1/2为宜,凝结后即成
斜面培育基。待灭菌后三角瓶内的培育基冷却至45~50时,以无菌操作法向无菌培育皿中倒入培育基,装
置以刚覆盖整个培育皿底部为宜(约15ml),凝结后即成平板培育基。
五、高压蒸汽灭菌法
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该法使用高压灭菌锅,在

121℃,

压力下灭菌

15~30min。微生物实训所需的全部器皿、器
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具、培育基

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(不耐高温者除外

)、无菌水、工作服等物件都可用此法灭菌。
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高压蒸汽灭菌锅是能耐必定压力的密闭金属锅,有立式或卧式

(实图

8-1、2)两种。
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灭菌锅上附有压力表、排气阀、安全阀、加水口、排水口等。卧式灭菌锅还附有温度计。有的还有蒸汽
人口。灭菌锅的加热源有电、煤气和蒸汽三种。
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高压蒸汽灭菌的操作过程
(1)加水将灭菌锅内层灭菌桶拿出,再向外层锅内加入适当的水,以水面与三角架相平为宜。立式锅
是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。
(2)装料将装料桶放回锅内,装入待灭菌的物件。搁置装有培育基的容器时要防备液体溢出,瓶塞不
重要贴桶壁,以防冷凝水沾湿棉塞。
加盖摆正锅盖,对齐螺口,而后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓,翻开排气阀。
排气用电炉或煤气加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一同从排气孔排出。一般以为,当排气流很
强并有嘘声时,表示锅内空气已排净(沸后约5min)。
升压当锅内空气排净时,即可封闭排气阀,压力开始上涨。
实图7-1立式灭菌锅实图7-2卧式灭菌锅



(6)保压当压力表指针达到所需压力刻度时,控制热源,开始计时并保持压力至所需时间。本实训用
121℃、20rnin灭菌。
(7)降压达到所需灭菌时间后,封闭热源,让压力自然降落到零后,翻开排气阀。放净余下的蒸汽
后,再翻开锅盖,拿出灭菌物件,排掉锅内节余水。
(8)无菌检查将已灭菌培育基冷却后置于37℃恒温箱内培育24h,若无菌生长,则放人冰箱或阴凉处保
存备用。
。能
损坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂,如重金属离子等;仅阻抑细菌代谢机能,使细菌不可以
增殖的化学药剂为抑菌剂,如磺胺类及大多抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌仍是杀菌以及作用效
果,还与化学药品浓度的高低、办理微生物的时间长短、微生物的种类及微生物所处的环境等相关。
微生物实训室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、%新洁尔灭、%升汞、3%~5%
的甲醛溶液和75%乙醇溶液等。

使用高压灭菌锅应严格依据操作程序进行,防止发惹祸故;灭菌时,操作者切勿私自走开;务必待压力降到零后,才可翻开锅盖。
干热灭菌时电烘箱中物件不要摆得太拥堵,免得阻挡空气流通而影响灭菌成效;灭菌物件不要与电烘箱内壁的铁板接触,以防包装纸烤焦。
记述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。
六、实验报告(思虑题)
?牛肉膏蛋白胨培育基中不同成分各起什么作用?
?在制备培育基的过程中应注意些什么问题?为何?
、数目,并图讲解明其配制过程,指明重点。
,为何一定立刻灭菌?已灭菌的培育基怎样进行灭菌检查?
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