PCR培训教材(DOC9页).doc

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标准的PCR实验室简介设计规划
1、主体体结构:
主主体为彩钢钢板、铝合合金型材。室室内所有阴阴角、阳角角均采用铝铝合金50内圆角铝铝,从而解解决容易污污染、积尘尘、不易清清扫等问题题。结构牢牢固,线条条简明,美美观大方,密密封性好。
2、标准的三区分隔和气压调节:
将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区,同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。
可打开缓冲区Ⅰ,缓冲区Ⅱ和PCR扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
3、消毒:
在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。
在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
4、机械连锁不锈钢传递窗:
试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。
5、地面
地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm。
6、照明
灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。
在建设的过程中应注意:
●规范的安装流程和全面的服务流程。
●严格按照规范科学设计的安装流程。
●安装前需要确定以下安装条件,如:电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水压,最小安装空间,地面平整度,通风孔、进水管和下水管的位置等,理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。
实验室平面面布局示意意图
注:(1)试试剂准备和和标本制备备区之间、标标本制备和和扩增区之之间各有一一传递窗传传递试剂等等物品,根根据人物分分流原则,实实验人员由由缓冲间经经内走廊单单向走入下下一区间。非非实验室工工作人员不不得进入内内走廊。
(22)三个区区均配备独独立空调。试试剂准备区区和标本制制备区均由由外向内排排风,保持持室内正压压。扩增区区由内向外外抽风,保保持室内负负压。
(33)三个区区间配备移移动紫外灯灯各一台。
PCR装机机培训
一、装机前准备备
1、询问需装机机单位是否否有移液器器(必须有有的量称为为2ul、25ul、100uul、200uul等)、加加热装置(杭州奥盛盛干浴锅温度必须须达到1000℃)、台式高高速离心机机(转速必必须达到130000rpmm)、低速离离心机分离离血清(转转速必须达达到35000rpm以上)、震震荡混匀器器。最好再配配掌式离心心机(用于于将管壁上上液体甩到到管底)否否则只能用用手甩。
2、自带物品::移液器tip头(200uul的黄枪头头和10ul的小枪头头)、薄膜膜手套、乳乳胶手套、、、离离心管架。如如有必要可可自带移液液器,规格格分别为::--10ull、5-500ul、20-2200ull、100--10000ul。
3、如果要自带带试剂,一一定要领取取乙肝(HBV)荧光定定量核酸检检测试剂盒盒(罗氏专专用试剂盒盒),还要要配套带好好免抽提标标准品(两两盒试剂配配一套免抽抽提标准品品)。
4、清点设备::PCR仪一台、电电脑主机一一台、电脑脑显示器一一台、打印印机一台。
二、路上注意事事项
1、PCR仪一一定要小心心轻放、保保持正面向向上,千万万不能倒置置。
2、如果携带试试剂盒,要要在泡沫箱箱中放入冰冰袋,保持持低温保存存。
三、装机
1、查看场地,PCR实验室最最好能分为为三个:⑴⑴样本处理理(加样)室室、⑵反应液配配制室、⑶扩增室。
2、将电脑显示示器、主机机、打印机机和PCR仪连接好好,查看是是否可正常常运行。
3、将装有试剂剂盒的泡沫沫箱打开,把把试剂盒以以及免抽提提的标准品品存放入--20℃的冰箱,如如马上使用用,可存放放在4℃的冰箱待待用。
四、实验
(一)标本本处理:在在样本处理理室进行,处处理标本时时需要戴乳乳胶手套。
1、打开加热装装置,把预预设温度调调到1000℃。
2、标本由装机机单位提供供,可选取取阳性和阴阴性标本各各一、二个个。
3、。
4、打开试剂盒盒,取出标标本处理液液A和B,将两者者分别混匀匀待用。
5、在每一个离离心管中加加入100uul标本处理理液A,然后再再逐一加入入血清液100uul(每一个个都要换枪枪头),盖盖上盖子,做做好标记,在在震荡器上上震荡混匀匀(若没有有振荡器可可人工颠倒倒混匀,并并用手指弹弹打数次)。
6、放入台式高高速离心机机中,130000rpmm离心10分钟。注注意:在离离心时必须须保持离心心管的平衡衡,离心机机有内盖的的要盖内盖盖。离心管管的放置必必须保持管管背突出部部分一致向向外,以便便在吸取上上清液时不不带走所需需的核酸片片断。
7、离心完成后后,小心取取出离心管管,尽量少少震动,防防止核酸片片断从底部部被带起,轻轻轻打开离离心管,从从离心管腹腹部开始慢慢慢吸取上上清液,不不要碰到底底部和外侧侧部的核酸酸片断,尽尽量一次性性把200uul的上清夜夜吸干净,若若不行也可可分两次进进行,但不不要反复吸吸打,以避避免核酸片片断被带起起。(吸取取上清液时时,离心管管按从离心心机取出的的方向倾斜斜,移液枪枪头斜向插插入离心管管底部,吸吸出的200uul上清液是是不用的)
8、在离心管中中加入标本本处理液B255ul(在加的的时候注意意枪头不要要碰到离心心管的管壁壁,以免交交叉污染),用用震荡器充充分混匀,低低速离心数数秒,放入入加热装置置中,1000℃加热10分钟,取取出放入台台式高速离离心机中,130000rpmm离心10分钟。
9、上清液(此此上清液指指的是第8步配成的的液体)作作为模板待待用。
10、若要用试剂剂盒中的标标准品,则则与标本相相同处理。
(二)反应应液的配制制:在反应应液配制室室进行,戴戴薄膜手套套,以避免免乳胶手套套上的荧光光粉粘在毛毛细管上,影影响荧光的的读取。
1、取出试剂盒盒中的反应应液A(蓝色)B(绿色)C(棕色),待待完全溶化化后,分别别混匀后,低低速离心数数秒,待用用。
2、在干净的离离心管中按按一人份比比例为A:B:C=9:8:1的比例(即即一人份,反反应液A9uul、B8uul、C1uul)配制反反应液,配配制时一般般要求多配配制一人份份(即n+1人份),充充分混匀后后,按每一一管18ul量,分装装于毛细管管上面开口口的底部。(干干净离心管管的大小按按实际配制制量自行调调整,)
(三)加模模版:在标标本处理室室进行,戴戴薄膜手套套。
1、将免抽提的的标准品取取出,完全全溶化后,充充分混匀,低低速离心数数秒,待用用。
2、将标本和免免抽提标准准品(或抽抽提好的标标准品)按按每个2ul逐一加入入毛细管开开口底部的的反应液中中(一定要要加到反应应液中,不不可挂壁,以以防止两者者没有混融融,造成实实验失败),每每一个都要要换枪头。
3、每一次实验验都要带四四个标准品品(107、106、105、104)和一个个阴性(阴阴性对照液液也包括在在试剂盒中中)。
4、用圆头镊子子逐一将每每一个毛细细管的盖子子盖好,不不要用尖头头的镊子,以以免把毛细细管的盖子子顶穿。
5、把毛细管放放入离心架架上,将离离心管架放放入离心机机中,低速速离心数秒秒(不要超超过30000rpm,以防毛毛细管断掉掉)。
6、将毛细管取取出,上机机。
注意事项::
1、所有的的试剂和反反应液(A试剂、B试剂、C反应液)都要在振振荡器上单单独混匀。
2、奇数的的试管要加加一根200uul水的子弹弹头变成偶偶数配平后后均衡放入入离心机后后离心,以以免不平衡衡。
3、1000℃干浴锅孵孵育时间10分钟+3分钟,孵育育时可打开开锅盖以免免爆子弹头头瓶盖。
4、高速离离心机速度度>130000转(可设150000转),时间可可适当延长长>10分钟。
5、放入高高速离心机机时,记住住子弹头的的统一放置置方向,抽抽提上清液液时,将移移液器的量量调至205uul,枪头朝朝离心反方方向的底部部倾斜抽提提。
6、毛细管管盖上盖子子后低速离离心数秒,插插入仪器时时往下按一一下。
上海科华((FluoCyccle型)仪器操作作程序
(FluooCyclle型)核酸扩增增荧光定量量检测仪的的正确和正正常使用。
(FluooCyclle型)荧光定量PCR仪分析的的所有实验验过程。
(FluooCyclle型)仪器操作作使用说明明书。
。

,键键入用户名名和密码登登录;
;;
,进入入FluooCyclle软件主主界面;
“编辑运行”进入样品品信息设置置界面,稍稍后屏幕提提示“是否现在在开始自检检?”对话框;;选择“Yes”,机器即即进入自检检;选择“No”,机器即即跳过自检检。自检结结束后,屏屏幕显示“自检通过”,点击“OK”后,进入入样品设置置界面;[机器只需需在每天第第一次实验验前自检一一次,自检检:空卡盘盘(未插入毛毛细管的样样品盘)放在机器器中,放下下盖子,点点击“Yes”进行自检检;如果自自检结果显显示“错误”,则记下下报错信息息,并与科科华公司技技术服务部部联系]。

,点击“新建文件”,新建一个个实验项目目;
“输入检测测样品总数数”后“回车”,“编辑样品”编辑,或或运行结束束后再进入入样品信息息设置界面面更改,但但样品个数数在仪器运运行后不能能再修改;;在“类型”中可选“未知”(样品)、“标准”和“阴性”,每次实实验一般都都带标准和和阴性做(阴阴性是必须须带的,去去除工作液液受到污染染的影响,除除非保证实实验室完全全无污染),标标准的已知知浓度根据据试剂标准准说明书上上的值输入入(譬如3E7、3E6、3E5、3E4、3E3),+00,项目名名称可单独独输入也可可整体输入入。
“打开文件件”,可对已有有项目进行行编辑;
“清除输入”可清楚输输入信息重重新填写;;
“保存修改”将保存输输入的样品品信息;
“运行”,仪器开开始样品找找位,并进进入温度设设置界面。

“新建参数”,按试剂说说明书要求求设定实验验循环参数数;
编辑循环参参数时,只要输入“第一目标标温度”、“温度保持持时间”、“采样方式”和“循环次数”
譬如4步循循环(机器器自带,可可以直接打打开参数调调用,文件件存在C:\PProgrramFFiless\pcrrsofttwaree\expp目录下的KHB文件)
右下框的的名称第一目标标温度温度保持持时间采样方式循环次数数
1、(预预热1)500120SS不采样11
2、(预热热2)931120S不采样11
3、(采采样)99310SS不采样40
66030SS采样
4、(散散热)44010SS不采样11
注:第三步步循环中的的第一阶段段温度保持持时间10S是正确的的,试剂说说明书上写写的3S是错误的的。
,点击击“保存参数”;
,点击“打开参数”即可调用用;
,点点击“运行”进入运行行界面,开开始检测,此此时禁止打打开盖子。
实验程序运运行界面结结构:上方方为荧光实实时显示图图:显示每每个样本实实时荧光值值,记录每每个样本荧荧光值变化化趋势;下下方为温度度实时显示示图:显示示运行过程程中的实际际温度值;;
若温度实时时显示图显显示的波形形不是规则则的或不均均匀的,说说明仪器的的温度控制制部件有故故障;若荧荧光实时显显示图显示示的波形不不是正常的的图形,很很可能是光光路对位置置光偶有问问题。
发射波长是是470,接收滤滤光片的波波长F1/5530、F2/6640、F3/7710(平时只只用F1/5530单波长)。
,软软件自动保保存数据,转转入FluooCyclle数据分分析主界面面。

,进入入数据分析析界面,软软件自动加加载当前的的实验数据据,也可点点击左下角角“打开文件”打开一个个已经有的的实验,进进行离线的的分析;
“方差法”和“最小二乘乘法”两种数据据分析方法法;
::选择方差差法,设置置起始点(默默认3)、终止止点(默认认8)和系数数(),点击击红色按钮钮“方差法分分析”,直到得得到较好的的结果;
起始点和终终止点都是是指横坐标标循环次数数第几次对对应的荧光光值,适当当修改起始始点、终止止点和加大大系数值相相当于向上上拉动“噪声带设设置框”、提高CT阈值。
:选择择最小二乘乘法,显示示方式选择择“log”,拉动“噪声带设设置框”的噪声带带设置线(图图中黑色的的水平线),按按住鼠标左左键,上下下移动基线线,至刚刚刚覆盖阴性性对照正常常扩增曲线线顶部位置置/且正好所所有曲线都都处在刚好好开始均匀匀规则的上上升处,且且阴性对照照CT值为零,点点击按钮“最小化误误差”,得到各各标本的检检测结果;;或者拉动动CT阈值设置置框中的黑黑色水平线线设置阈值值,但阈值值只能在噪噪声带以上上位置移动动(经验丰丰富的操作作者,可不不用拉动“噪声带设设置框”的黑色水水平线,直直接拉动CT阈值黑色色水平线到到正好所有有曲线都处处在刚好开开始均匀规规则的上升升处设置阈阈值,然后后点击“CT值分析”即可);;
,软件均均可自动地地计算CT,绘出标标准曲线和和相关系数数r,并计算算样品浓度度值。
,点击“保存结果”,否则打印报告时仪器自动读取调整前的默认数据。
注:完成后后进行数据据分析,若若实验结果果中由标准准品求得的的标准线较较好(相关系数数不小于实实验规定数数据/非常接近-,标准样样本点几乎乎都在标准准直线上)时,也可不用用做调整。
标准曲线的的创立:结结果分析完完成后,点点击“保存标准”,在弹出出的对话框框点击保存存创立并保保存本次实实验的标准准线。
大部分情况况下相信仪仪器通过方方差法自动动测得的值值,不用执执行最小二二乘法分析析操作。
标准曲线的的调用:在在数据分析析界面,点点击“调用标准”,仪器提提示“将调用已已有标准曲曲线进行分分析,但不不保证计算算结果的准准确性!”,点击“ok”,在弹出的的对话框中中选择要导导入的标准准曲线,点点击“ok”打开导入,实验数据据由软件自自动分析得得出。

,点击击“打印报告”,进入打打印界面;;
,点点击“病人信息息设置”,在跳出出的对话框框中输入病病人信息,点点击“保存修改”;
,点点击“打印检验验报告”,即可打打印病人报报告;
“打印检验验报表”,可打印印综合检验验报告。
10结束工工作
,关关闭FluooCyclle软件;;
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,用退管管器取出毛毛细管,按按照有关规规定处理用用过的毛细细管;
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上海科华((FluooCyclle型)荧光定量量PCR仪维维护保养程程序
,以确确保仪器正正常运行,结结果准确规规范。
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,用用干净软布布清洁机器器表面尘土土;
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,可可先用10%次氯酸钠钠浸泡的棉棉签对样品品盘及机器器内外壁消消毒,再用用蒸馏水或或70%乙醇醇浸泡的棉棉签清洁;;
注意事项::
a)记好操操作记录。
b)非本室室人员使用用该仪器,需需在本室人人员的指导导下操作。关关机前,应应由本室人人员检查仪仪器是否正正常方可关关机。操作作人员和本本室人员同同时签字。不不可自行挪挪动仪器,不不可自行拆拆开仪器间间接口。
注:该仪器器由厂家每每年定期校校准维护。
上海科华((FluooCyclle型)荧光定量量PCR仪校校准程序
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,应应及时与厂厂商联系对对仪器进行行校准。
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附:注意事事项
a)仪器应应放置在水水平坚固的的平台上,外外界电源系系统电压要要匹配,并并要求有良良好的接地地线。
b)环境温温度保持在在23℃左右,湿湿度保持在在60%左右。对对于潮湿的的省份,推推荐配备除除湿机。
c)仪器应应配备合适适的UPS或稳压器器。
e)仪器使使用时应严严格遵守上上述使用步步骤。
Fluoccyclee实时荧光PCR仪加热丝丝更换说明明书
一、准备工工具:
1、内六角角扳手(3#)一把。
2、十字螺螺丝刀一把把。
3、小型平平头螺丝刀刀一把。
二、更换步步骤:
1、切断仪器电电源开关。
2、等仪器冷却却后,打开开仪器盖子子,拆去上上盖外围三三颗内六角角螺丝,将将帽子拿下下,见下图图。
内六角螺丝3颗
3、松开接线柱柱上连接加加热丝导线线的两颗一一字螺丝,将将导线轻轻轻取出,拆拆去加热腔腔上面固定定加热丝的的两颗十字字螺丝,见见下图
十字螺丝2颗
一字螺丝2颗
4、抓住导线将将加热丝从从加热腔垂垂直拿出,小小心不要将将腔内壁的的绝缘片带带出或划破破。
5、将备用加热热丝原样垂垂直装回。注注意:加热热腔内壁贴贴有绝缘片片,安装时时请保证绝绝缘片紧贴贴腔体内壁壁。
6、确定加热丝丝已安放后后,旋紧固固定螺丝,再再将导线固固定到接线线柱上。
7、上盖帽子原原样安放好好,先将三三颗内六角角螺丝分别别旋上,在在确定三颗颗螺丝都旋旋上后,均均匀将螺丝丝旋紧。
8、更换完毕。