实验三酵母核酸的制备及成份鉴定.pptx

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(先打开水浴锅,温度设置成100摄氏度)
一、目的
二、原理
三、器材
四、试剂和材料
五、操作
六、注意事项
一、目的
了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法以
了解苔黑酚定量测定RNA的方法。
二、原理
酵母核糖核酸中RNA含量较多,RNA可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀,即得到RNA的粗制品。
核糖核酸中含有核糖、嘌呤碱,嘧啶碱和磷酸各组分,加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。
,磷钼酸中的钼在有还原剂(Vc)存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。
。
,后者能与3,5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛,它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
三、器材
锥形瓶
大研钵
电子天平
离心机
恒温水浴锅
注意仪器使用方法
离心管平衡!!
四、试剂和材料
酵母粉
,95%乙醇,,浓氨水,
酸性乙醇溶液:30ml95%。
苔黑酚--FeCl3溶液:将100mg苔黑酚溶于100ml浓HCl中,,临用时配制。
定磷试剂:按顺序以A:B:C:蒸馏水=1:1:1:2(V/V)混匀,现配。A、17%H2SO4: 将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。B、%(NH4)6Mo7O24:(NH4)4Mo2O7溶于100ml蒸馏水中。C、10%Vc:10gVc溶于100ml蒸馏水中,用棕色瓶贮存。颜色呈淡黄色时可以使用,如呈深黄或棕色则失效。
五、操作
1、酵母RNA的提取(2-3人一份)(先以少量NaOH溶液湿润酵母,并充分研磨),将悬浮液转移到250ml锥形瓶中,在沸水浴30分钟,不时搅拌,冷却后转入离心管进行离心.----(蛋白质变性沉淀,RNA溶于碱性溶液)
离心10min(4000rpm),将上清液倾入10ml酸性乙醇溶液中,待核糖核酸沉淀完全后,离心3min(4000rpm),弃去上清。---RNA不溶于乙醇,pI=)
用95%乙醇洗涤沉淀,离心3min(4000rpm)弃去上清液,共进行两次。沉淀可在空气中干燥,即为酵母RNA的粗制品。
五、操作
2、RNA水解液的制备:取200mg提取的核酸,,在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分的鉴定。
3、RNA组分的鉴定:①嘌呤碱:取水解液1ml加入约1ml ,然后加入过量的浓氨水,观察溶液的变化。②核糖:取1支试管加入水解液1ml,加三氯化铁-盐酸溶液2ml,,放沸水浴中10分钟,注意溶液颜色的变化。③磷酸:取1支试管,加入水解液1ml和定磷试剂1ml,在水浴中加热,观察溶液颜色的变化。
(浓氨水\FeCl3-浓HCl\定磷试剂在通风柜中)
六、注意事项
,并进行充分研磨,再用剩余的NaOH溶液冲洗研钵一起转入离心管。提取时,注意每个步骤的目的和意义
:为什么提取率各组间会出现较大的差异