水解度指标测定.pdf

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方法一:(前三酮比色法)
(1)标准曲线制定:
1、20g/ml甘氨酸:2mg甘氨酸定容到100ml容量瓶中。
2、前三酮显示剂:,,,磷酸二氢钾6g,定
,避过低温保存1周。
3、40%^醇
标准曲线制作
试管012345678待测
样品


前二酮显示1111111111
剂ml
摇匀,沸水浴15min,用冷水迅速冷却至室温
40%^醇ml5555555555
甘氨酸g0246810121420??
OD(570nm)
因甘嬴酸的分子量为:,换算成-NH?的呻。1数的AQ关系:
水解度计算公式:DH-—>100%
水解液-心曲含萼5凹一原料蛋白质中游高_也含量(响0g)
h^irnmol/g)
xioo%
所以米糠蛋白的加广73477
N----水解液蛋白含量(凯氏定氮)
F-----
方法二:采用甲醛滴定法。
水解度(%)=(水解后生成的氨基氮的量/样品中总氮含量)X100%
(1)粗蛋白含量的测定:采用凯氏定氮法。
(2)氨基氮的测定
氨基酸含有氨基和埃基,具有两性,加入甲醛与氨基酸中的氨基作用,可消除其碱性,使
埃基显示出酸性,用氢氧化钠标准溶液滴定,即可对氨基酸进行定量。
1、酚猷指示剂:%的乙醇中
2、中性甲醛溶液:甲醛溶液(36-37%,分析纯)50ml,%的酚猷指示剂约
3ml,,储存丁棕色瓶中,临用前配制。
具体方法如下:
分别吸取2mL不同水解度的水解液丁烧杯中加蒸僻水5mL,向烧杯中加入5滴酚猷指示
剂,,。同时取同浓
度但未水解的蛋白液2mL做空白实验。
、V-
百甘£人n/n
国基炎[含里(ing/inL)=-----------------
10
式中:
V—样品耗用氢氧化钠标准溶液毫升数;
V0—空白耗用氢氧化钠标准溶液毫升数;
N—氢氧化钠标准溶液摩尔浓度;
—(mg)。
方法三:

采用pH-Stat滴定法啊任”根据多肽在不同pH的条件下解离状态不同:置pH位
恒定时酶水解蛋白后形成的自由梭基,自由氛基或氨基艘残基数目不等;当在碱性条
件卜水解时,释放的氨基酸使溶液pHffl明显卜'降,用稀碱液将其滴盅回起始pH值,
可以知道蛋自质的肽健断裂的情况,根据消耗的碱量计算水解度DH值。
水解度=(水解的肽健数/总肽键数)xlOO%
计算公式:(,龄)乂
DH=VWNNa0H/0MpH100%2-2
公式V滴定消耗的碱体积(mL)
中:N1Ce!
滴定消耗的碱当量浓度
NNa0H:(jnol/L)
Mp;参加蛋白水解的蛋白总量(g)
Hy每克蛋白中肽键的克当量数()
a:a-g基酸的平均解离度(S0T肘,pK=)d=10pHpK/(1+10
归谜)
pK=+2400*(298-T)/298T
T=+tt:反应环境的温度(莒)
pH:反应起pH值
(DH)的测定
贫白质的水解程:度常以蕴白质中的肽锤被断裂的臼分率来•费示,常见的水解度测定和监控的方法主
要有pH-stat法(Alder-Niggen,1986).三硝基苯璜酸法、甲醛滴定法、三氟乙酸沉淀法等,由于pH-stat法具有
操作简单,连续测定的优点,,水解过程中加入碱的果与断裂的肽键的数鼠有定/的关
,本酬究采用该法来检测大米蛋白的水解度,
X100
h-^xjV^xl/ccxl/M
式中:h——单位质量蛋白质中被水解的肽奥的量(mindg1);
B—消耗的碱液体积,niL;
N.——碱液的浓度,molt;
1/a校11:系数<碱性蚩白的1如=1,01):
M#——底物中蛋白质的含晴,争
——底物中蛋白质中的肽键总数,mmol/g()().
氮溶指数测定(TCA-NSI)
可以通过检测其氮溶解指数来初步判定小肽或寡肽含量。
NSI(%)=(N1/N0)*100
N0=总氮
N1=可溶性氮(用三氯乙酸——可溶性氮测定法)
三氯乙酸(TCA)是一种蛋白质沉淀剂,它可以沉淀蛋白质和较长的肽段。可以被三氯乙酸沉淀的肽段所含
的最少氨基酸残基数与底物的种类有关,就特定的底物而言,三氯乙酸氮溶解指数可以定性反映蛋白质的分
解情况,溶解指数越高,表明较短肽段含量越高。
三氯乙酸氮溶指数(TCA—NSI)测定方法:
将20ml10%三氯乙酸(TCA)溶液添加到20ml待测混合液(混合液浓度为10%),混合液震荡,静置10分
钟,在4000转/分下离心20分钟,取上清液测可溶性总氮。(福林酚法比色法)。
抗氧化活性测定方法
(一)试剂盒法测抗氧化活性