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PCR技术-
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法,也是分子生物学实验最常用到的一种方法。根据适用对象的不同,又有荧光实时PCR、逆转录PCR等区别。本专题详细介绍了PCR实验的基本原理、步骤及常见问题的解决办法。
第一部分:PCR的基础知识
第一章:聚合酶链式反应(PCR)的历史和发展
本文章内容包括:聚合酶链反应的历史回顾、聚合酶链反应相关技术的发展、其它体外核酸扩增技术、PCR技术的应用举例。
第一节:聚合酶链反应的历史回顾
1、核酸体外扩增最早的设想
由Khorana及其同事于1971年提出:―经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重视该过程便可克隆tRNA基因‖。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物,且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,所以,使Khorana等的早期设想被人们遗忘。
2、聚合酶链反应的发明
直到1985年,美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于
DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热,因此,每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时,这一过程耗时,费力, 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化,继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪,使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金。
二、聚合酶链反应相关技术的发展
PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。
(表)聚合酶链反应的相关技术
三、其它扩增技术
与PCR及其相关技术发展的同时,新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利弊,与PCR互为补充,有的可结合应用,共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我们相信,随着分子生物学技术的发展,这一家族一定会再涌现出新成员。
㈠连接酶链反应(A)
连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman 1997
年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明,并申报了专利。
LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。
LCR的扩增效率与PCR相当,用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环,94℃min变性和65℃复性并连接,循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等,还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断,微生物的种型鉴定,癌基因的点突变研究等。
㈡依赖核酸序列的扩增(A)
依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) ,又称自主序列复制系统(self-sustained sequence replication,3SR)或再生长序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。
NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。
其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,65℃1min使RNA分子二级结构打开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase H,并在37℃反应1~,其产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。
NASBA的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于PCR,特异性好。
㈢转录依赖的扩增系统(A)
转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification sytem,TAS),是 Kwen
等人于1989年研究报道的,主要用于扩增RNA。
TAS的主要特点是扩增效率高,因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加,只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是