生化实验一总糖和还原糖含量的测定 (2).doc

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(3,5-二硝基水杨酸法)
一、目的要求:
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。
 二、实验原理:
在NaOH存在的条件下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色  桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:,溶解后移入1000ml容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000ml。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml,。
6mol/LHCl:取250ml浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500ml。
碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6NNaOH:称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。
%酚酞指示剂。
2、材料
山芋淀粉
四、器材
723型分光光度计,分析天平,水浴锅,研钵,烧瓶,试管若干等。
五、操作
1、葡萄糖标准曲线制作
取干净试管6支,按表1进行操作。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg∕ml)为横坐标作图得标准曲线。
表13,5-二硝基水杨酸法定糖—标准曲线的制作
管号
试剂
0
1
2
3
4
5
标准葡萄糖溶液∕ml
0





蒸馏水∕ml





0
DNS试剂∕ml
2
2
2
2
2
2
沸水浴中准确煮沸5min,取出,用自来水冷却至室温
蒸馏水∕ml






葡萄糖含量∕mg
0





A540nm
0





2、样品中还原糖的提取与测定
,加蒸馏水约3ml,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。于50℃,不时搅拌,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到100ml离心管中,于4000r∕min下离心5min,沉淀用20ml蒸馏水洗一次,再离心,将两次离心的上清液合并,用蒸馏水定容至100ml,混匀,作为还原糖待测液。取1ml进行还原糖含量测定。
3、样品总糖的水解及提取
,加蒸馏水约3ml,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/LHCl10ml,,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I2-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解完毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6NNaOH溶液中和至溶液呈微红色,并用蒸馏水定容至100ml,过滤,取滤液10ml于100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液。取1ml总糖水解液,测定其还原糖含量。
六、结果处理
1、各浓度标准葡萄糖溶液按表1进行反应后,溶液吸光值见表1。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg∕ml)为横坐标作图得标准曲线。如图1所示。
图1葡萄糖标准曲线
经分析得标准曲线回归方程为:y=+,相关系数R2=。
2、还原糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm处的吸光值为:A1=
将A1代入回归方程得c1=
还原糖(mg∕g)=(c1×100)∕m
=
3、总糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm处的吸光值为:A2=
将A2代入回归方程得c2=
总糖(mg∕g)=(c2×1000×)∕m
=
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml;
m──样品重量,g;
──。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色。
 
七、思考题
,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的原理?
、氢氧化钠和碘-碘化钾溶液的作用是什么?