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罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书
(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)
一、原理:
TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radishperoxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂
器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;
(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);
(converter-POD)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
;
~100μlDAB底物,反应15~25℃×10min;
;
,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)
对于培养细胞的预处理:
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸,干燥后在去离子水中漂洗,干燥后4℃保存;
②适当方法诱导细胞凋亡,同时设未经诱导的对照组,各组离心收集约1×106个细胞,PBS洗一次,重悬,加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上,自然干燥,使细胞很好的吸附到载玻片上;
③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min;
④PBS浸洗二次,每次5min;
⑤%的TritonX-100中处理5min;
⑥PBS浸洗二次,每次5min;
后续操作如同石蜡包埋切片的6-15
四、注意事项
,每次清洗5min。
,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。
×DAB溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。
(MethylGreen)染液(3-5%)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。
,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。
;未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃);3号液(converter-POD)液一旦解冻,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6m内稳定,避免再次冻存;TUNEL反应液临用前配好后,放至冰上直至使用。
:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。
现象
可能原因
建议
非特异性染色
TdT酶的浓度过高
用TdTdilutionbuffer*作1︰2—1︰10稀释
TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。
注意控制反应时间,并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂)
尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用)
确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液
采用推荐的固定液
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂
用含有dUTP和dAPT的溶液封闭
标记率低
如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)
%多聚甲醛固定
或福尔马林或戊二醛固定。
固定时间过长,导致交联程度过高
减少固定时间,%多聚甲醛固定
荧光淬灭
Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭,需注意避光操作
促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低
增加通透剂促渗时间
2、增加通透剂的作用温度(15-25℃)
3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min)
4、℃作用30min。
荧光背景很高
支原体污染
请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
TdT酶的浓度过高或反应时间过长
用TdTdilutionbuffer*作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间
红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
阳性对照没有信号
DNaseI的浓度过低
冷冻切片使用3u/ml的DNaseI
石蜡切片使用1500u/ml的DNaseI
一般样本使用10u/mlDNaseI
组织样本从载玻片脱落
组织样本被酶从玻片消化下来
降低蛋白酶K的处理时间
常见问题的原因及推荐解决方案
TdTdilutionbuffer:60mMKPB缓冲液(),150mMKCl,1mM2-mercaptoethanol,50%Glycerol