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基因重组与基因工程
ic bination and ic engineering
郭军
Nanjing medical university• Biochemistry and molecule biology department
重组 DNA 技术
binant DNA technology
一、重组DNA技术相关概念
克隆(clone) 原意是指复制(copy), 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
技术水平:
分子克隆(molecular clone)
即DNA 克隆,基因克隆
细胞克隆
个体克隆(动物或植物)
DNA克隆
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA (binant DNA) 。
实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为重组DNA技术(binant DNA technology)或基因工程(ic engineering)
限制性核酸内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
聚合酶(Taq酶、末端转移酶) —用于DNA和RNA的合成
末端修饰酶(多聚核苷酸激酶、碱性磷酸酶)—用于核酸末端修饰
其它酶类—用于细胞的破壁,转化,核酸纯化,检测等
二、常用的工具酶
1. 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
TAGG
TAG
G
+
Bam HⅠ
50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:
hsd R---限制性内切酶 hsd M---限制性甲基化酶 hsd S---控制两个系统的表达
主要来源于原核生物
限制-修饰系统
I型:能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性。
II型:识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断。
III型:识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部。
分类
在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶
第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;
第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;
第四个字母代表株;
用罗马数字表示发现的先后次序。
II类限制性内切酶的命名
Hin dⅢ
属系株序
Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
5’
3’
3’
5’
严格识别顺序的特点——回文结构(palindrome)
特点:呈二元旋转对称
舟行水面水行舟