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肽黄金检测方法
一、胰蛋白酶抑制因子的测定
(一)材料:
1、Tris buffer溶液:(tris) Cacl2·, , 再用水稀释至1000ml。
2、BAPA溶液:-DL-精氨酸-Β-硝基替苯氨(BAPA)盐酸盐(Sigma公司产品),用预热到37℃的Tris buffer溶液稀释到100ml。
3、猪胰蛋白酶溶液:(Sigma公司产品) HCl作为储备液; buffer溶液稀释至100ml。
4、30%醋酸溶液:。
(二)样品制备:
,,在涡旋搅拌器上搅拌3min, Tris buffer溶液。室温下静止10min,待大部分固体絮状物质凝集下来后用滤纸过滤(豆粕样品提取液再用Tris buffer溶液稀释40或20倍)。
(三)反应:
1、样品空白和试剂空白:。在37℃下保温20min, BAPA
溶液,混合后在37 ℃下保温10min, 30%醋酸溶液中止反应, 用Tris buffer溶液稀释的猪胰蛋白酶溶液。
2、样品和标准: Tris buffer溶液(作标准), BAPA溶液后在37℃下保温20min,,然后在水浴中保温10min, 30%醋酸溶液中止反应。
(四)测量:
在385nm(或410nm)下用试剂空白校零和测定标准、样品和样品空白的吸光值,计算每ml稀释液读数减去其空白读数之后与标准读数之间的差值。(TIU)。
胰蛋白酶抑制剂含量TIU/g=2×〔(样品OD385nm -样品空白OD385nm)-标准液
OD385nm〕×稀释倍数N/〔(-)×〕
二、大、中、小分子蛋白质含量的测定
(一)原理:高分子含氮物质在酸性溶液中,易为单宁沉淀。而磷钼酸可同时沉淀高、中分子含氮物质,低分子含氮物则不为上述物质所沉淀。因此,测定单宁沉淀样品后滤液的含氮量,用总氮减去此值即得到高分子氮。再测磷钼酸沉淀样品后所得滤液的含氮量,即为低分子氮。用单宁沉淀样品所得滤液的含氮量减去低分子氮,即为中分子氮。
(二)试剂:
1、H2SO4:;
2、单宁溶液:;
3、钼酸钠溶液:。
(三)操作:
1、先测总氮,其总氮值记为W;
2、用单宁沉淀:
加一定量的样品( 左右的氮)于200ml的容量瓶中,加水到18