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试验一 SOD
试验一: 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化
及活力测定
一、原理
超氧化物歧酶(Superoxidedismutase,SOD)是一种能专一地清除超氧离子自由基(0)的金属酶,对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定,其催化反应为:2H+2O2 H2O2+O2 不同,可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体,呈蓝绿色;Mn-SOD呈紫红色;Fe-SOD呈黄褐色。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行纯化。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性,酶活性单位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250 (Coomassic brilliant blue G-250)在游离状态下呈红色,与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内,溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比,可用比色法测定,测定范围1-1000ug。
二、实验试剂与器材
[试剂]

①ACD抗凝剂:柠檬酸10g柠檬酸钠30g,葡萄糖25g,用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml ②%NaCl:称取NaCl ,溶于100ml蒸馏水中
③丙酮
④95%乙醇
⑤氯仿

①50 mmol/L
②10 mmol/L EDTA钠盐溶液
③3 mmol/L邻苯三酚溶液(用10mmol /L盐酸配制)
-250法测蛋白质
①考马斯亮蓝G-250试剂:称取l00mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%(W/V)的磷酸,蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。
②标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清白蛋白25mg,加蒸馏水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸馏水稀释至100ml,即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。
[器材]
分光光度计;分析天平;具塞试管;刻度吸管(1ml,5ml);离心机;烧杯(50ml); +-2-
三、操作步骤

[1]取新鲜猪血20ml(:1(V/V)的比例加入ACD抗凝剂),4000r/m,10min,去上层血浆,取下层红血球粘稠液,并量其体积,然后加入
%NaCl溶液清洗,4000r/m,10min,弃上层清液,%NaCI溶液重复清洗一次,4000r/m,10min,得洗净的红血球浓稠液。
[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水,剧烈搅拌30min,使其充分溶血。%,匀浆呈暗红色,再继续搅拌15min,4000r/m,10min,去变性蛋白沉淀物,得上层液,留样2mL。将上层液用多层纱布进行粗滤,以除去上层液中的漂浮物,然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理,15min后取出迅速冷却至室温,4000r/m,5min除沉淀,得浅黄色粗酶液,留样2mL。
[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液,冰箱中