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专利名称:一种基于锌指蛋白插入载体的随机锌指蛋白库的构建方法
技术领域:
本发明属于锌指蛋白库技术领域,涉及一种基于锌指蛋白插入载体的随机锌指蛋白库的构建方法。
背景技术:
锌指类蛋白广泛分布动植物和微生物中,其中人类基因组中就有将近I%的序列编码锌指结构的蛋白,锌指蛋白的共同特征是蛋白质通过与Zn2+的结合,使自身折叠成指状多肽结构。根据Cys(C)和His(H)残基的数目和位置不同,锌指蛋白可分为CCHH、CCCH-CCCC,CCHC,CCCH等亚类。C2H2锌指结构域于1983年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中被发现,是迄今在真核生物基因组中分布最广的一类蛋白。这种锌指蛋白由大约30个氨基酸残基组成ββα的结构,每个锌指结合3个连续的核苷酸序列。其结构比较固定并且亲和力强,所以非常适合设计人工DNA结合蛋白。目前在ZiFDB(/)数据库中有888种锌指,主要包括四类SangamoBioSciences:他们设计一类三联体锌指蛋白,其中每个锌指都识别GNN核苷酸序列。Barbaslaboratory:他们采用模块组装的方法设计了大量能识别不同的三联体核苷酸序列的锌指蛋白。
Toolgen:他们从人类基因组中编码的锌指蛋白中筛选获得锌指蛋白。Jounglaboratory:他们采用OPEN的方法创造了大量三联体锌指蛋白,其识别9bp的靶序列。获得人工联体锌指的方法可分为两类筛选法和模块组装法。模块组装法的优点在于简易快速简单将各锌指模块连接用于识别目标序列。缺点在于设计出的联体锌指亲和力较低或者没有亲和力。随着锌指结合DNA机制深入研究,该方法将会成为一种高效的方法;筛选法可信度较高,但比模块组装法耗时并需要较高分子实验技能。发明说明本发明解决的问题在于提供一种基于锌指蛋白插入载体的随机锌指蛋白库的构建方法,通过构建将具有简并性的随机锌指蛋白表达序列插入到表达载体中进行转化,得到了高容量的随机锌指蛋白库,为锌指蛋白的筛选奠定了基础。本发明通过以下技术方案来实现一种锌指蛋白插入载体,包括启动子和抗生素筛选基因,在启动子的下游含有Galllp基因序列,在Galllp基因序列的下游含有锋指蛋白序列插入位点。所述的启动子为Lac_UV5启动子;。所述的锌指蛋白插入载体为pBD-P-Galllp-ZFR,通过酶切位点将lac_UV5启动子克隆到载体pBD,然后将Galllp基因序列克隆到lac-UV5启动子的下游,再将锌指蛋白序列的插入位点ZFR克隆到Galllp基因序列的下游。所示的Lac_UV5启动子的核苷酸序列如
;;。一种随机锌指蛋白序列,。一种随机锌指蛋白表达载体,-P-Galllp-ZFR载体的锌指蛋白序列的插入位点ZFR中;所述的pBD-P-GalIIp-ZFR载体,是通过酶切位点将Lac_UV5启动子克隆入载体PBD,然后将GalIIp基因序列克隆到Lac_UV5启动子的下游,再将锌指蛋白序列的插入位点ZFR克隆到Galllp基因序列的下游而构成。一种随机锌指蛋白库的构建方法,包括以下步骤I)分别克隆Lac_UV5启动子元件、,然后按照Lac-UV5-galIIp-ZFR的顺序将3个序列克隆到pBD载体中,构建pBD-P-GalIIp-ZFR载体;2)根据锌指蛋白的-1,1,2,3,5,6位点设计随机引物,;3)-P-GalIIp-ZFR载体的锌指蛋白序列的插入位点ZFR中,得到pBD-P-GalIIp-ZFS表达载体;4),将pBD_P_GalIIp-ZFS表达载体转化宿主菌,收集经过氯霉素抗性筛选后的所有单克隆,提取质粒,将得到的所有质粒混匀,得到随机锌指蛋白库。所述的粘性末端的酶切是对随机锌指蛋白序列用
pfuDNApolymerase内切活性进行酶切。所述的随机锌指蛋白序列通过BbsI酶切位点插入到pBD-P-GalIIp-ZFR载体中。所述的pBD-P-GalIIp-ZFS表达载体的转染是采用电转化的方法。电转化条件,电穿孔仪参数电压1800V,持续时间5ms;电击杯规格Gap(mm),MinimumVolume40μI,MaximumVolume400μI。与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果目前锌指蛋白库的构建方法报道比较少,最常用的锌指蛋白库是向JoungLab购买单指锌指库,然后通过重叠PCR的方法构建所需要的锌指库。然而单指锌指库有74个,每个库单独售价为65$,购买所有单指锌指库需要4440$(/)。由需要从国外递送质粒,程序很繁琐。本发明基于锌指蛋白结构特点设计兼并引物,通过重叠PCR的方法构建随机锌指库,其具有以下优点I)构建方法简单,使用分子生物学常规方法就可完成,基本所有分子生物学实验室都具备这一条件。只需要PCR仪和电穿孔仪两种仪器,通过PCR、酶切、连接、电转化和质粒提取即可完成。2)成本低,本方法的主要费用是兼并引物合成、限制内切酶BbsI、电击杯、dTTP和一些实验室常用试剂和器材费用。
3)周期短,锌指蛋白插入pBD-P-Galllp-ZFR载体构建,只需在骨架载体中插入3个DNA片段即可完成,大概需要两周时间。随机锌指库构建只需在
pBD-P-GalIIp-ZFR载体插入随机锌指蛋白序列,再电转化宿主菌,提取质粒即可完成,不超过3天即可完成。4)库容量大,此随机锌指蛋白库包含了所有识别9bp核苷酸序列可能的锌指蛋白,
图I为pBD-p载体单酶切鉴定的结果图;图2为pBD-p-galllp载体PCR鉴定的结果图;图3为pBD-P-GalIIP-ZFR载体PCR鉴定的结果图;图4为pBD-p-galIIp-ZFR载体的质粒图谱;图5为随机锌指蛋白库构建原理图;图6为ZFF123片段的扩增结果图;图7为pBD-p-galIIp-ZFS载体的质粒图谱;图8为pBD-p-galIIp-ZFS载体在BL21中的表达。
具体实施例方式本发明提供一种随机锌指蛋白库的构建方法,包括锌指蛋白表达插入载pBD-P-GalIIp-ZFR的构建、随机锌指蛋白序列的构建以及随机锌指蛋白表达载体pBD-P-GalIlp-ZFS,在将其转化并表达后获得高容量的随机锌指蛋白库。下面结合具体的实施方式对本发明进行详细的说明,所述只是对本发明的解释而不是限定。首先提供以下培养液/载体的来源或制备pBD载体、pTRG-galllP载体、pBD_LGF2载体购于TaKaRa公司。大肠杆菌DH5α
购于天根公司。SOB培养基改良型配方(1L体系):胰化蛋白胨20g;酵母提取物5g;;KCl10ml(250uM)。SOC培养基改良型配方(1L体系):胰化蛋白胨20g;酵母提取物
5g;;KClIOml(250uM));(20%)。氯霉素(34mg/ml)。IPTG(100mg/ml),。I、随机锌指插入载体pBD-P-GalIIP--P载体的构建设计引物Plac-F、Plac-R从pBD载体上克隆lac_UV5启动子Plac-Fgcttatcatc_gataagctaattctcactcatta;Plac-Rgttagcggcc_gctttgaagacctcatacgctgtttcctgt;其中,划线部分为酶切位点;Lac_uv5启动子的扩增体系pBD载体Iul;引物Plac-F2ul;Plac-R2ul;pfuDNApolymeraseIul;pfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTPIul;-uv5启动子的扩增条件95°C3min;95°C30s,58。。45s,72。。45s,30cycle;72°CIOmin。然后分别用ClaI和NotI双酶切pBD载体(切除pBD载体上的λCl0RF)及PCR扩增的Lac-UV5启动子,回收酶切片段后,T4DNA连接酶4°C过夜连接;将连接产物转化DH5a,涂菌液于含氯霉素抗性(34ug/ml)的LB固体培养基上37°C倒置培养。挑取单克隆,菌落PCR鉴定并测序,鉴定正确后得到pBD-P载体。pBD-P载体的酶切鉴定结果如图I所示,其中M为marker(lOObp,250bp,500bp,750bp,IOOObp,2000bp,3000bp,5000bp);泳道4为pBD载体,泳道1、2和3为pBD载体单酶切(插入Lac_UV5启动子的pBD_P载体中含有BbsI酶切位点,而骨架载体
pBD不含有BbsI酶切位点),片段大小为2511bp。lac-。-P-Galllp载体的构建设计引入酶切位点的引物Galll-F、Galll-R,以PTRG-Galllp为模板扩增GalllP片段Galll-Fgcc￡aagacattatgcctcaacagcagcaa;Galll-Rgacgcggccgccaaagcttggatttttctca;其中,划线部分为酶切位点;GalIIp的扩增体系pTRG载体Iul;引物Gal11-F2ul;GalIl_R2ul;PfuDNApolymeraseIul;PfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTPIul;ddH2029ul。Galllp的扩增条件95°C3min;95°C30s,58°C45s,72°C45s,35cycle;72°CIOmin。然后分别用BbsI和NotI双酶切pBD-P和扩增的Galllp片段,回收酶切片段后DNA连接酶4°C过夜连接;将连接产物转化DH5a,涂菌液于含氯霉素抗性(34ug/ml)的固体培养基上37°C倒置培养。挑取单克隆,菌落PCR并测序鉴定,鉴定正确后得到pBD-P-GalIIP载体。pBD-P-GalIIp载体的PCR鉴定结果如图2所示,其中M为marker(100,200、300、400、500、600),泳道I,2,3,4,5,7为构建正确的克隆,其PCR鉴定条带大小为296bp。。-P-GalllP_ZFR载体的构建设计引入酶切位点的引物ZFR1、ZFR2,通过重叠PCR方法得到锌指蛋白插入序列ZFRZFRlcgatgcggccgctgactacaaagattctagacccRRRRaRRtcttctaaRtRataa
;ZFR2gcatggatccttactactgtgcatgtcttcttacttatcacttaRaaRacctcc;其中,划线部分为两端重叠引物搭桥序列。重叠PCR所合成的锌指蛋白插入序列ZFR如下()CGATGCGGCCGCTGACTACAAAGATTCTAGACCCGGGGAGGTCTTCTAAGTGATAAGTAAGAAGACATGCACAGTAGTAAGGATCCATGC其中,划虚线部分为酶切位点NotI和BamHI,划实线部分都为酶切位点BbsI。BbsI限制性内切酶的识别位点和切割位点不相同,通过合理设计可以在酶切后去除BbsI酶切位点,以消除酶切位点DNA序列的影响。ZFR的扩增体系ZFR12ul;ZFR22ul;pfuDNApolymeraseIul;pfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTP2ul;ddH20ul37ul。
ZFR的扩增条件-MV3min;94°C30s,58°C30s,72°C45s,25cycle;72°CIOmin0然后分别用NotI和BamHI双酶切pBD_P_GalllP和扩增的ZFR片段,回收酶切片段后DNA连接酶4°C过夜连接;将连接产物转化DH5a,涂菌液于含氯霉素抗性(34ug/ml)的固体培养基上37°C倒置培养。挑取单克隆,菌落PCR并测序鉴定,鉴定正确后得到pBD-P-GalIIP-ZFR载体。pBD-P-GalIIP-ZFR载体的菌落PCR鉴定结果如图3所示,其中M为Trans2kDNAmarker(从上而下大小为2000,1000,750,500,250,IOObp)4,6,7,为阳性克隆,1,2,3,5阴性克隆。根据设计引物目的片段大小为753bp。
所构建的PBD-P-GalllP-ZFR载体的质粒图谱如图4所示,其中,插入的3个元件的排列顺序为Lac-UV5-GalIIp-ZFR;Lac-UV5是一种中等强度的启动子,其负责Galllp和锌指序列转录和翻译。Galllp可以与Gal4两者相互作用,能够调控启动子转录与否,已被广泛应用于蛋白质与蛋白质或做研究中,如细菌双杂交系统和酵母双杂交系统。这样使得所构建的载体、锌指蛋白库能够用双杂交系统进行筛选。ZFR为锌指蛋白序列插入位点,包含两个BbsI酶切位点,酶切后能产生于锌指蛋白序列配对的粘性末端,并且能去除载体中含有的BbsI酶切位点,以消除酶切位点对锌指蛋白序列影响。2、随机锌指蛋白序列的构建C2H2锌指结构域于1983年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFIIIA中被发现,是迄今在真核生物基因组中分布最广的一类蛋白。这种锌指蛋白由大约30个氨基酸残基组成ββα的结构,每个锌指结合3个连续的核苷酸序列。其结构比较固定并且亲和力强,所以非常适合设计人工DNA结合蛋白。本发明设计三指随机锌指蛋白库,其识别9bp核苷酸序列。锌指蛋白具有保守的序列,其结合核酸的位点为其_1,1,2,3,5,6位点,即这六个位点为可变氨基酸。根据上述锌指蛋白序列结构特点和密码子兼并性,设计引物,通过重叠PCR方法获得随机锌指蛋白序列(构建流程如图5所示)。针对识别9bp核苷酸的所有序列的随机锌指蛋白序列,所设计的随机引物为
ZFFllgagcgccccttccagtgtcgcatttgcatgcggaacttttcgvnsvnmvnvnwcttvnwvnmcatacccgtactcatac;ZFF12cgcatacagatccgacactgaaacggtttttcaccggtatgagtacgggtatg;ZFF2Igtgtcggatctgtatgcgaaatttctccvnkvnmvnsvnmttgvnwvnkcatctacgtacgcacacc;ZFF22tcggcattggaatggcttctcgccggtgtgcgtacgtagatgZFF31gccattccaatgccgaatatgcatgcgcaacttcagtZFF32ccctcaggtgggtttttaggtgknbmnbcagsnbmnbknbmnbactgaagtgcgcatg;ZFAlggggagcgccccttccagtgtcgc;ZFA2gtgcagaggatcccctcaggtgggtttttaggtg;其中,N代表A、T、C、G;V代表G、A、C;S代表G、C;M代表A、C;胃代表八、丁;K代表G、T;随机锌指蛋白序列的扩增程序为ZFFll与ZFF12的扩增ZFF1,扩增体系(50ul)为ZFFlIIul(50uM);ZFF121ul(50uM);pfuDNApolymeraseIul;pfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTPIul;ddH2041ul;ZFF21与ZFF22的扩增ZFF2,扩增体系(5Oul)为ZFF2IIul(5OuM);ZFF221ul(50uM);PfuDNApolymeraseIul;pfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTPIul;ddH2041ul;ZFF31与ZFF32的扩增ZFF3,扩增体系(50ul)为ZFF31Iul(50uM);ZFF321ul(50uM);pfuDNApolymeraseIul;pfuDNApolymerasebuffer5ul;dNTPIul;ddH2041ul;扩增条件为-MV3min;94°C30s,50°C30s,72°C30s,6cycle