原位杂交具体步骤.doc

原位杂交流程
以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检
测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系
统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。
在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、
酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。
下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。
主要操作步骤
制备感受态细菌
用含目的基因的质粒转化细菌
小量培养转化的细菌
小量提取质粒
小量酶切质粒
电泳鉴定
大量培养转化的细菌
大量提取质粒
大量酶切质粒
电泳分离、回收及纯化
标记探针
石蜡切片的处理
预杂交、杂交
杂交后处理
抗体连接、显色

制备感受态细菌

【试剂及配制】
1LB液体培养基
在900ml三蒸水中加入
胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g
酵母提取物(bacto-extract) 5g
NaCl 10g
磁力搅拌使完全溶解用5mol 如用进口试剂则不必调。定
容为1000ml高压灭菌20min。
2 CaCl2溶液
溶于90ml三蒸水中定容至100ml
于灭菌试剂瓶中4℃保存。
【材料】
大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】
1从37℃培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌
落转入含有5ml LB培养基的无菌试管37℃振摇200r/min过夜。次日取菌液1ml
加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶37℃振摇培养200300r/min约23h
将烧瓶取出立即置冰浴1015min
2以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心
管中
34℃离心5000g × 10min回收细菌
4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液
5 CaCl2 10ml 重悬菌体置冰浴30min
64℃离心5000g × 10min弃上清倒置于滤纸上1min
7加4ml CaCl2 重悬菌体动作要轻
8置4℃冰箱1224h即可用于转化。


感受态细菌的冻存

一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。 EP 管中沸水浴
10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份每份加30%体积的甘油充分混匀
置-70℃冰箱一年内可使用。


用含目的基因的质粒转化细菌

【试剂及配制】
1LB液体培养基
2氨苄青霉素Amp选择性培养基
%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷
却至50℃左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp
选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入即每ml培养
基加入1μl氨基苄。
3氨苄贮存液
将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液1ml一份
分装存于-20℃。

【操作方法】
1无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的
感受态细菌时将其从-70℃冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200μl 转移至
10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用
2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min
342℃水浴热休克90s不要摇动试管
4每管加无抗生素的LB培养基1ml37℃摇床温和摇振100150r/min45min
5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200μl菌液铺于含氨苄青
霉素的琼脂平板表面37℃放置20min然后倒置培养1420h37℃。


小量培养转化的细菌

【操作方法】
1取灭菌处理的10ml 玻璃试管用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基再加入
50mg/ml 氨苄青霉素5μl
2用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口