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分离名词解释
10 蛋白质复性
包含体(inclusion body) 重组蛋白质的高表达常常导致其在细胞内发生错误折叠和聚集,形成被成为包含体的聚集体。
包含体主要由蛋白质构成,其中大部分是基因表达产物,这些基因表达产物的一级结构是正确的,但立体结构是错误的,没有生物活性。
以包含体形式表达的蛋白质,需要在回收后溶解,使其肽链伸展(unfolding),然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。这一过程称为蛋白质的体外再折叠(refolding)或复性(renaturation)。
包含体的形成
氨基酸顺序决定了蛋白质的立体结构。理论上蛋白质折叠成天然活性状态是自发完成的,但伸展的肽链折叠成立体结构的过程受周围环境的影响。
包含体是在表达产物翻译后立即形成,包含体内的表达产物具有部分二级结构。
一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态(intermediates)之间疏水性相互作用的结果,主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质,或表达产物周围的物理环境(如温度、离子组成)不适或缺少某些折叠辅助因子(如分子伴侣)的作用。
在大多数情况下,包含体的形成是蛋白质过量表达的结果,而与蛋白质种类和表达系统无关。
对于任何蛋白质和任何表达系统,在过量表达的情况下都可能形成包含体。
活性产物N的形成为分子内折叠反应,折叠速率与浓度成正比;聚集体A的形成反应在分子间发生,反应速率与浓度的高次方成正比,即反应级数≥2。因此如果新生肽折叠成天然活性蛋白质的速度缓慢,新生肽浓度增加和中间态的疏水性相互作用就可能导致包含体的形成。
外源基因基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体,许多蛋白质药物的生产依赖于蛋白质复性技术的提高。
蛋白质的错误折叠和聚集还可能与许多重要疾病(如阿尔茨海默症、疯牛病、帕金森症等)有关。
包含体的性质
较大的包含体由于其折光性的不同,可以在显微镜下观察,所以包含体又称光折射体。以包含体形式表达重组蛋白质具有一定优势:
1、包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成,有利于大规模生产目标蛋白质;
2、一般包含体蛋白质的表达量都很高;
3、包含体富含目的基因表达产物,有利于后续的分离纯化;
4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解;
5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物,以包含体形式表达是最可取的生产途径。
包含体的体内抑制
如果能有效地进行蛋白质的体外复性,可充分发挥包含体蛋白质表达系统的优势。
有效蛋白质很难进行体外复性,特别是相对分子质量较大,结构复杂和含有较大二硫键的蛋白质,此时应抑制包含体的生成,提高可溶性蛋白质的表达量。
方法:降低细胞培养温度,减缓蛋白质的表达速度和降低表达量;将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达,弥补外源蛋白质表达过程中缺乏的辅助因子;使用非代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量;将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达 包含体的分离纯化
蛋白质复性过程包括包含体的分离纯化、包含体的溶解已经复性等步骤。
包含体的分离从细胞破碎开始,以离心沉降或膜分离方法分离回收包含体。
包含体纯度对复性收率影响显著,为实现较高的蛋白质复性收率,必须进行包含体的纯化,除去质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质,降低蛋白质的聚集体生成速率,促进复性方向向正确折叠的方向进行。
包含体分离纯化的一般过程:
1、细胞破碎:为提高下一步的离心效果,需进行高强度的破碎。
2、离心沉降回收包含体:较高转速下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞碎片,回收沉降的粗包含体。
3、粗包含体的洗涤:加入螯合剂EDTA及低浓度变性剂或表面活性剂,溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质。
4、离心沉降回收包含体。
包含体的溶解
获得适当纯度的包含体后,需溶解包含体,是目标蛋白质肽链伸展,为进一步的复性创造条件。
通常用高浓度的强变性剂溶解包含体。
溶解的包含体蛋白质中仍会有一些杂质存在,如蛋白质、核酸和细胞膜组分等。为提高复性收率,在复性前可对变性/还原的蛋白质进一步纯化。主要纯化方法有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱和固定化金属离子色谱等。
纯化操作中要保持蛋白质的溶解状态,还可将变性蛋白质交换到酸性溶液中,冻干保存。复性前重新溶解。
蛋白质复性
降低变性剂浓度至非变性范围内可引发变性蛋白质的重折叠复性。对含有二硫键的蛋白质,其复性过程需要添加氧化剂和还原剂,条件复性液的氧化还原环境,促进正确二硫键的形成。一般认为疏水性作用在蛋白质折叠过