第七章重组体克隆的筛选和鉴定
转化子与筛选的概念
转化子(transformant):导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。
筛选(screening):将重组体的转化子细胞或转染噬菌体群体从其它细胞群体中分离出来,并要鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因的过程。
筛选方法的类型
1. 直接筛选
根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同,分为:
针对载体携带某种或某些选择标记基因(selectable marker genes)、报告基因(reporter gene)或目的基因而设计的筛选方法。
特点:直接测定基因或基因类型
2. 间接筛选
不要直接鉴定基因,而是利用其它方式,例如利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用,进行对重组体的筛选。
第一节载体表型选择法
第二节根据插入基因的表型选择
第三节 DNA电泳检测法
第四节核酸杂交检测法
第五节免疫化学检测法
第六节转译筛选法
第七节几种常见的真核生物重要基因选择方法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
第一节载体表型选择法
1. 原理:
pBR322
(1)四环素:
(2)氨苄青霉素抗性基因:
2. pBR322抗菌素标记选择
产生-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液(I2-KI-Aampicillin)(蓝灰色)褪色。
抑制细菌生长,但不杀死细菌。
杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。
(3)环丝氨酸:
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