PCR RT-PCR protocol.doc

第一章 PCR和RT-PCR基础
PCR基础
聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程,因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般,经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分(表1)。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA;由RNA转化得到的cDNA;或未经纯化的粗制生物样品,如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增,但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液,三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点(Tm),忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1. 反应成分
Component  Final Concentration
Template  10^4-10^6 copies of DNA template
Primer 1  -µM
Primer 2  -µM
10X Reaction buffer  1X
Magnesium  -
dNTP mix  200 mM each dNTP
Thermostable DNA polymerase  1-4 units/100 ml reaction
RT-PCR基础
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。
图1. RT-PCR概图
这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。高灵敏性(从小量样品中得到足量结果)和高特异性(选择性地仅得到所需的产物)是成功PCR的标志。可以通过仔细的实验设计(如选择恰当的酶,设计最理想的引物,使用不同的缓冲液和添加剂,确定循环参数及制备高质量的模板等)以获得最佳的RT-PCR和PCR。
第二章增加RT-PCR灵敏度
分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。Trizol试剂法(见下图)将一步法加以提高,可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
TRIzol®试剂步骤略图
一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA,都可以检测到扩增结果(图2)。另外,分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化,从而使信息的检出和定量产生偏差。然而,当分析稀有mRNA时,poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较
以5或1μg Hela细胞总RNA(分别为泳道1和2)或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA(分别为泳道3和4)。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段,两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。
为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4